第 1 章 文献综述
1.1 正粘病毒
正粘病毒是一类基因组为分节段、单股、负链RNA的病毒。目前正黏液病毒科可以分为五个属，其中三个属为流行性感冒病毒，分别是A型、B型及C型流行性感冒病毒，另外两个属是 Isavirus 病毒属和 Thogotoviruses 病毒属(Palese and Shaw,2007)。在2009年，研究者基于序列分析提出了由Quaranfil、Johnston Atoll、和 LakeChad 病毒组成的第六个有可能为正粘病毒的病毒属(Presti et al., 2009)。正粘病毒的宿主非常广泛。A型流感病毒可以感染包括人在内的多种哺乳动物及禽类，它可以引起流感流行和大流行并引发大规模的死亡(Wang and Palese, 2009)。B型流感病毒能够感染人以及海豹(Osterhaus et al., 2000)，而C型流感病毒能感染人以及猪(Guo etal., 1983)。索戈托病毒（属于Thogotoviruses 病毒属）也可以感染人类，它通常是由壁虱来传播的(Jones and Nuttall, 1989)。传染性鲑鱼贫血症病毒（属于Isavirus 病毒属）可以感染大西洋鲑鱼以及其他的鲑鱼种类(Raynard et al., 2001)。鉴于其他的正粘病毒在形态、基因组组成、病毒粒子结构和复制周期上都与其非常相似，本研究将聚焦于A型流感病毒和传染性鲑鱼贫血症病毒。
1.1.1 A 型流感病毒的概述
流感病毒感染是每年都受到关注的主要的公共健康问题。A型流感病毒是一种能够引发伴随很高死亡率的广泛流行的病毒。为了更好的预防并治疗流感病毒感染，对流感病毒的基本分子生物学特性有一个综合性的理解是非常关键的。A型流感病毒是流感流行和大流行的致病病毒，它是有包膜的单股负链RNA病毒 (Lamb and Krug, 2001)。A型流感病毒有8条线性的单股RNA，编码12种病毒蛋白，包括PB1、PB2、PB1-F2、N40、PA、NP、HA、NA、NS1、NEP、M1和M2(Medinaand Garcia-Sastre, 2011) (Palese and Shaw, 2007)。其中，第二条RNA编码3个蛋白，聚合酶组成成分PB1、一个小的蛋白PB1-F2、以及一个PB1的N端截短片段N40。第七条RNA编码M1和M2，第八条RNA编码NS1和NEP，这都是通过mRNA的选择性剪接来实现的。流感病毒的结构以及重要结构性蛋白的列表在图1-1中有显示。
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1.2 M1 蛋白
许多囊膜病毒中都含有基质蛋白，包括副粘病毒、正粘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。作为一种主要的结构蛋白，基质蛋白通常能够直接在病毒脂质膜的下方形成一层单层蛋白质基质。基质蛋白也被称为病毒装配的―适配器‖，因为它们能够介导病毒包膜或糖蛋白的尾巴与病毒的核糖核蛋白（RNP）复合物之间的相互作用，从而促进病毒的基因组进入到新装配的病毒中。病毒的基质蛋白还能够通过加强结构的刚性为病毒的囊膜提供结构支持，并且有时候基质蛋白能够帮助调节或维持病毒的形状(Gaudin et al., 1995; Noda et al., 2002)。除了它们在结构方面的作用，许多病毒的基质蛋白已经被证实能够调节基因组的转录和复制活动(Hoenen et al., 2010; Suryanarayana et al., 1994)。正粘病毒家族所有的成员，包括流感病毒A、B、C、索戈托病毒属，以及Isavirus，都编码基质蛋白，并称为M1。在A型流感病毒中，M1蛋白是由基因片段7线性转录形成的(Lamb and Lai, 1981)。A型流感病毒的M1蛋白在该病毒的生命周期中起着十分重要的作用。首先，在病毒进入宿主细胞时，内涵体中的病毒内部发生酸化，减弱了病毒RNPs与M1蛋白之间的相互作用，RNPs被释放，并通过NP蛋白上的核定位信号进入到细胞核内为病毒的复制和转录做准备(Bui et al., 1996; Neumann et al.,2000)。随着感染的进一步进行，当新合成的M1蛋白中的一部分进入到核内后，能够在细胞核内与新合成的RNPs结合，并介导它们的出核。如图1-8所示，根据―daisy-chain‖模型，M1的C端区域与vRNP结合(Baudin et al., 2001)，而M1的N端区域则是与NEP（也叫作NS2）的C端结合，NEP再通过它富含亮氨酸的核输出信号与细胞的输出蛋白Crm1以Ran GTP依赖的方式相结合。这样就形成了一个大的复合体(Crm1–Ran GTP)–NEP–M1–vRNP，这个复合体带着vRNP跨越核膜，最终来到装配的地方(Akarsu et al., 2003)。有研究表明，M1与vRNP在细胞核中的结合能够阻止mRNA的转录(Baudin et al., 2001; Ye et al., 1987)。也有研究者认为M1与病毒包膜以及新组装的vRNP之间的相互作用能够提高病毒出芽的效率(Ye et al., 1987)。在细胞质中，M1能够与HA和NA的胞质尾区相互作用，从而促进M1与脂筏膜结合并随后引发M1聚合，帮助出芽病毒颗粒的延伸(Gomez-Puertas et al., 2000; Ruigrok et al.,2001)。与膜结合的M1蛋白能够作为一个招募病毒RNPs的停靠点，同时也能够介导招募M2到病毒出芽的部位(Chen et al., 2008; Rossman and Lamb, 2011)。M1的序列变化与病毒形成丝状或者球状的病毒颗粒是相关的(Calder et al., 2010)。有报道称，单独表达M1能够介导病毒样颗粒（VLPs）的单个蛋白出芽，这说明M1是A型流感病毒装配和出芽的主要驱动力(Gomez-Puertas et al., 2000; Latham and Galarza, 2001)。
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第 2 章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
培养基及抗生素：酵母浸出物和胰蛋白胨从 OXOID 公司购买，氨苄霉素和卡那霉素购买于 Invitrogen 公司。核酸处理相关：琼脂糖和 DNA Ladder marker 从 fermentas 公司购买，PCR产物回收试剂盒和质粒小提试剂盒均购于天根公司。各种限制性内切酶、T4 连接酶、PrimerStar 酶及 Taq 酶从 TAKARA 公司购买。蛋白质处理相关：二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基磺酸钠(SDS)、异丙基-β-D-硫代吡喃半了糖苷（IPTG）、四甲基二乙胺（TEMED）、丙烯酰胺、β-巯基乙醇（β-2ME）、过硫酸胺购于国药集团，蛋白 Marker 从 fermentas 公司购买、Bradford 蛋白质定量试剂盒从碧云天生物技术公司购买、Ni-sepharose 树脂从GE Healthcare 公司购买、蛋白酶抑制剂从 Amresco 公司购买。抗体：单抗anti-GST 和 anti-His 抗体分别购于ABclonal 和PML 生物公司，异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate， FITC)标记的鼠二抗购于 Clontech公司。蛋白质晶体相关：蛋白质晶体生长条件筛选试剂盒从 Hampton Research 公司购买，此外，母液也从 Hampton Research 公司购买。其他试剂：三羟基甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钠（NaCl）等试剂均购于国药集团。
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2.2 方法
对于用于结晶的蛋白，构建质粒的第一步是要决定使用哪种表达系统。这是一个尝试后失败再尝试的过程。通常首先从原核表达系统（E.coli.）开始，如果效果不佳，再尝试昆虫细胞表达系统或是哺乳动物细胞表达系统。在本研究中，E.coli.表达系统是首选，因为它操作简单、产量高且成本低。此外，在 E.coli.表达系统中，还可以很容易地将重原子结合到重组蛋白中，这样就可以用多波长异常衍射(Multi-wavelength Anomalous Diffraction, MAD)来确定相位。将酶切样品在 37℃反应时间 5h。酶切反应结束后，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳，切割目 DNA 条带，使用 DNA 凝胶回收试剂盒回收目的片段(方法同上)。利用紫外分光光度计测定纯化后的 DNA 片段浓度。
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第 3 章结果与分析 ......33
3.1 M1 及其他相关蛋白的纯化 ...........33
3.2 M1 蛋白晶体生长条件的筛选和优化 ...........34
3.3 M1 蛋白数据收集与结构解析 .......38
3.4 M1 蛋白晶体结构特征 ...........42
3.4.1 ISAV-M1 蛋白单体的结构特征 ....42
3.4.2 ISAV-M1 与 FLUA-M1 的结构比较.....46
3.4.3 ISAV-M1 的空间聚合状态 ....48
3.5 ISAV-M1 的膜结合功能.........52
3.6 ISAV-M1 的 RNA 结合功能 ..........56
3.7 低温冷冻电镜断层扫描技术研究 ISAV 病毒颗粒.......60
3.8 ISAV M1 和 NEP 的亚细胞定位 ...........62
3.9 ISAV M1 和 NEP 的相互作用 ..........65
3.10 Hsc70 与 ISAV M1 或/和 NEP 的共定位 .......65
3.11 Hsc70 与 ISAV M1 或/和 NEP 的相互作用 ...........67
第 4 章讨论 ..........71
第 5 章总结..........75
第 4 章讨论
本研究中报道的ISAV-M1的晶体结构首次让大家看到了正粘病毒家族基质蛋白全长的结构。每一个ISAV-M1分子都呈现肘部形状的结构，该结构由两个球状结构域通过一个柔性的连接区域链接形成。FLUA-M1的连接区域对蛋白水解的攻击高度敏感(Arzt et al., 2001; Okada et al., 2003)。而ISAV-M1的连接区域则不同，其氨基酸序列为112ESGCQDADGG121。也许是因为缺乏疏水性氨基酸或精氨酸、赖氨酸，这段连接区域对蛋白酶高度耐受，这使得到M1蛋白全长的晶体结构成为可能。通过对二级结构单元的重叠比较发现，ISAV-M1的N端结构域在结构上与FLUA-M1的N端结构域同源性较高（图3-19，图3-20）。虽然目前还没有解析出来FLUA-M1的C端结构域的X-射线结构，但是有些研究预测其结构是由四个α-螺旋组成(Shishkov et al., 2011; Shishkov et al., 1999)。FLUA-M1的C端结构域的这种高度α-螺旋化的结构也被一些溶液中的实验所证实(Arzt et al., 2001; Shishkov et al., 1999)。ISAV-M1的C端结构域相比其N端结构域来说，有着略高的结构上的柔韧性。其整体的温度因子都略高一些(例如B factor)，在三个NCS-相关的分子中，C端结构域分别为~74、88和66 2，而N端结构域则分别为~58、51和66 2。还有一些其他的证据能够说明ISAV-M1和FLUA-M1有着相似的结构和功能，包括：(1) ISAV-M1的肘部形状非常类似于在病毒粒子的负染EM图片中观察到的FLUA-M1的形状(Ruigrok et al.,2000)； (2) ISAV-M1和FLUA-M1在溶液中都呈现单体状态(Arzt et al., 2001)；(3)ISAV-M1展现出了与FLUA-M1类似的膜结合功能(Ruigrok et al., 2000)。
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总结
本研究通过解析 ISAV-M1 的晶体结构，研究 ISAV-M1 与脂质体、RNA、ISAV-NP、ISAV-NEP、宿主 Hsc70 的结合，从而阐明 ISAV-M1 的结构与功能，对本研究的内容总结如下：1.解析了全长ISAV-M1的晶体结构，分辨率达到了2.6 。这是国内外首次报道正粘病毒基质蛋白的全长晶体结构。ISAV-M1的晶体结构含有一个N端结构域和C端结构域，整体呈现一个肘形。N端结构域结构上与A型流感病毒M1蛋白的N端结构域高度相似。ISAV-M1的C端结构域通过一个延伸的Loop结构与N-domain相连，并且折叠成一个含有4个α-螺旋的螺旋束。2. 证实了ISAV-M1可以通过静电相互作用与膜结合，并确定了关键的膜结合位点是在N端结构域上的K63/K66/K68。3. ISAV-M1具有RNA结合活性，但是不与ISAV-NP蛋白结合。4. M1能与ISAV-NEP及宿主的Hsc70结合，M1单独表达时定位于细胞质和细胞核，但是与Hsc70共转染时能够与NEP共定位于细胞质中并聚集在细胞核周围。
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参考文献（略）