前 言
目前，临床上能用于治疗白念珠菌感染的抗真菌药物种类有限，且随着抗真菌药物临床使用量的增多，以及药物的选择性压力，致使白念珠菌的耐药现象不断增多，并出现交叉耐药，严重影响了药物的治疗效果[7]。同时，白念珠菌的致病力不是由单一因素决定的，其毒力因子和致病机制非常复杂，包括二相性转换、疏水性、粘附性、磷脂酶活性、天冬氨酸蛋白酶活性、溶血性等。由于白念珠菌的耐药性极高且致病机制复杂，因此，深入研究白念珠菌的耐药性和致病性，寻找新的抗真菌药物作用靶点，减缓并逆转耐药，将有助于对白念珠菌感染的预防和治疗，已成为国内外研究的热点[8]。本课题组前期研究发现，ADH1 基因及其编码蛋白 Adh1p 在耐药白念珠菌中的表达明显高于敏感菌，比较从外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）患者分离出的 20 株临床白念珠菌发现，ADH1 基因与外排泵相关基因 CDR1、CDR2 的表达呈正相关[9-11]；国内外其他研究者也陆续发现，白念珠菌 ADH1 基因很可能与菌株耐药和致病相关[12-16]。但是，目前关于 ADH1 基因是否确实参与菌株耐药和致病及其具体机制尚不明确，需要我们进一步研究证实。
本课题通过 SAT1-Flipper 基因敲除策略，首先成功构建了白念珠菌 ADH1 双等位基因缺失菌和单基因回复菌，并考察了该基因对菌株生长动力学的影响；随后，在进行菌株表型筛查实验时，我们采用多种方法分别从不同层面考察了 ADH1 基因对抗真菌药物敏感性的影响和对菌株致病力的影响；此外，由于 ADH1 基因编码的乙醇脱氢酶Ⅰ是白念珠菌糖酵解途径的关键酶之一，对菌株的能量代谢有重要作用，且有学者推测白念珠菌菌丝和生物膜的形成与菌株有氧呼吸、电子传递链和氧化磷酸化有关，因此，本课题还初步探究了 ADH1 基因对白念珠菌线粒体能量代谢的影响，旨在明确 ADH1 基因影响白念珠菌致病的具体机制及菌株有氧呼吸与无氧酵解的具体关系。
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1 白念珠菌感染的流行病学现状
白念珠菌（Candida albicans）又称白假丝酵母，归属半知菌亚门－芽孢菌纲－隐球酵母目－隐球酵母科－念珠菌属，为二倍体生物，与酵母菌不同的是，它没有有性生殖的过程，不会产生配子[17]，同时，白念珠菌为二相性真菌（Dimorphic fungus），根据外界环境不同可以菌丝，假菌丝和孢子三种不同的形态生长。白念珠菌广泛存在于自然界中，是目前引起人类感染最常见的机会性致病真菌[1-3]。当外部环境发生改变时，它能够由共栖态转变为机会性病原菌，引起皮肤、黏膜、呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统、中枢神经系统等多部位的感染，甚至引起威胁人类生命的念珠菌血症。白念珠菌易于感染、难以防治的主要在于其具有高致病性和高耐药性的特点，因此，近年来针对白念珠菌的研究也在临床受到广泛关注。近年来，随着恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病病人等免疫功能低下患者的不断增多，化疗药物、广谱抗生素及免疫抑制剂的大量使用，以及各种有创诊疗技术的广泛开展，真菌感染的发病率随之急剧升高[18]。最新的全球多中心系列调查 ARTEMIS 研究和SENTRY 计划结果显示，深部念珠菌感染病原菌的构成比发生了变化，非白念珠菌所占比例有上升趋势，但白念珠菌依然是深部真菌感染最主要的致病菌，分别占 65.3%和53.2%[19]，仍是引起免疫功能缺陷患者死亡的主要原因。近 20 年的国内真菌病原动态流行病学研究表明，白念珠菌感染呈明显上升趋势，从 1986 年的 5%骤升至 1996 年的19. 6%，至 2006 年已达到 26.9%[20]；一份国内 2013 年进行的多中心调查研究结果显示，由白念珠菌引起的侵袭性念珠菌感染占总数的 41.8%，患者接受治疗后病死率仍高达36.6%；另一份由中国医院侵袭性真菌检测网（CHIF-NET）发布的数据也显示，白念珠菌感染占侵袭性念珠菌感染病原菌总数的 50.1%[21-23]。国际上，综合美国 NHDS 和NCHS 的研究资料发现，美国临床患者中深部念珠菌感染的发病率由 1996 年的 23%升至 2003 年的 29%，而白念珠菌一直是最主要的致病菌；全球 39 个国家医疗中心收集的134715 株临床念珠菌致病株中，虽然白念珠菌的发病率有所下降，由 1997 年的 73.3%降至 2003 年的 62.3%，但仍占侵袭性念珠菌感染致病菌的首位；Alvarez-Lerma 等[24]调查了 641 个重症监护病房的 1562 个病例，发现有 15.9%的患者可分离出致病真菌，7.7%的患者并发真菌临床感染，其中白念珠菌占 68.9%。
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2 白念珠菌感染的治疗现状
近年来，尽管新型抗真菌药物不断被开发研究，但目前能用于临床治疗白念珠菌感染且安全有效的抗真菌药物十分有限，按其作用机制不同主要可分为以下几类（图 1）[25-27]：①唑类抗真菌药物：又分为三唑类和咪唑类，包括酮康唑（ketoconazole，KCZ）、氟康唑（fluconazole，FLC）和伊曲康唑（itraconazole，ITR）等，此类抗真菌药物以细胞色素 P450 为作用靶点，通过抑制羊毛甾醇-14α-去甲基化酶，阻断真菌细胞膜中麦角甾醇的生物合成通路，使真菌细胞膜的成分发生变化，细胞膜通透性改变，导致细胞内重要物质外漏，从而起到抑制真菌生长的作用，唑类药物由于具有良好的生物利用度、不良反应少、价格适中等优点成为临床上防治真菌感染的一线药物；②多烯类抗真菌药物：包括两性霉素 B（amphotericin B，AmB）、制霉菌素（nystatin）等，此类药物具有杀菌作用，主要通过与真菌细胞膜上的麦角甾醇结合，在真菌细胞膜上形成多孔，破坏细胞膜的流动性和稳定性，使细胞内的重要物质外溢导致细胞死亡，但其口服、肌肉注射均较难吸收，且不良反应多，肾毒性大，大大限制了其在临床的应用；③丙烯胺类抗真菌药物：如特比萘芬（ terbinafine）、布替萘芬（butenafine ）等，此类药物主要用于浅表真菌感染的治疗，通过抑制角鳖烯环氧化酶，减少真菌细胞膜中麦角甾醇的生物合成，同时角鳖烯的堆积又可导致细胞膜破坏，致真菌细胞死亡；④核苷类抗真菌药物，包括灰黄霉素和 5-氟胞嘧啶（5-FC）等，此类药物通过真菌细胞的酶系统进入细胞内，转换为氟尿嘧啶，替代尿嘧啶进入真菌的脱氧核糖核酸中，从而达到竞争性干扰真菌DNA 合成的作用；⑤棘白菌素类抗真菌药物：包括卡泊芬净（caspofungin）、阿尼芬净（ anidulafungin）和米卡芬净（micafungin）等，此类药物具有杀菌作用，通过非竞争性抑制β-1,3-葡聚糖合成酶，破坏真菌细胞壁结构，细胞破裂，内容物外泄导致真菌细胞死亡，棘白菌素类作为一类新型抗真菌抗生素，其应用时间相对较短，未广泛应用于临床。
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第三部分 ADH1 基因对白念珠菌致病力的影响.............（62）
1 实验材料.......（62）
2 实验方法.......（65）
3 实验结果.......（73）
4 讨论....（85）
第四部分 ADH1 基因对线粒体能量代谢的影响 .............（88）
1 实验材料.......（88）
2 实验方法.......（89）
3 实验结果.......（91）
4 讨论....（93）
第四部分 ADH1 基因对线粒体能量代谢的影响
1 实验材料
氨苄西林（Ampicillin，Amp），诺尔斯菌素（Nourseothricin，NAT）,XTT，甲萘醌（Menadione），2,7-二氢化荧光素（DCFH）等购于 Sigma 公司。酵母浸膏，酵母氮源，营养肉汤，葡萄糖，蛋白胨，琼脂以等购 BD 公司。氯化钠（NaCl），氯化钙（CaCl2），过氧化氢（H2O2），氢氧化钠（NaOH），磷酸氢二钠（Na2HPO4），磷酸氢二钾（K2HPO4），磷酸二氢钾（KH2PO4），碳酸氢钠（NaHCO3），二甲亚砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO），氯仿，丙酮等购于中国医药集团上海化学试剂公司。BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂盒：美国 Promega 公司。真菌/酵母细胞线粒体膜电位荧光测定试剂盒：上海杰美基因医药科技有限公司。真菌/酵母细胞内氧化应激活性氧（ROS）初级绿色荧光测定试剂盒：上海杰美基因医药科技有限公司。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：分别称取 NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO40.133g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g，加入三蒸水定容至 1000ml，121℃高压灭菌 15min，冷却至室温后，4℃保存备用。
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总 结
近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂和细胞毒性药物的大量使用，器官移植术、肿瘤放化疗技术的广泛开展以及免疫功能低下患者的不断增多，以白念珠菌为代表的系统性念珠菌感染的发病率和死亡率急剧上升，因此对于深部念珠菌感染进行系统研究具有重要意义，而耐药性和致病力是目前白念珠菌相关研究中两个最重要的方向。近年来已有零星报道推测 ADH1 基因可能与白念珠菌耐药和致病相关，本课题组前期研究也发现，ADH1 基因的表达产物 Adh1p 可能参与白念珠菌对唑类药物耐药，但这些推论迄今尚无直接证据支持。因此，我们首先通过直接敲除白念珠菌 ADH1 双等位基因，在验证前期实验预期的基础上，主要致力于基因敲除对菌株致病力影响的探讨，随后对菌株线粒体能量代谢的变化进行了初步研究，初步探讨其具体机制，为今后临床上防治白念珠菌感染及新型抗真菌药物的开发提供了重要的理论依据。
1、第一部分首先采用 SAT1-Flipper 基因敲除法成功构建了白念珠菌 ADH1 双等位基因敲除菌和单基因回复菌，并以套式 PCR 进行鉴定，所构建的突变菌株用于后续的表型分析，进而获得该基因的功能信息。同时结果发现，与亲本菌和回复菌相比，ADH1基因缺失菌在对数生长期并没有生长受限，因此其缺失与否对菌株的表型变化影响不大，且其能够在常规培养条件下存活，表明该基因不是白念珠菌生存必需基因。
2、第二部分通过微量液基稀释法和琼脂点板实验考察了 ADH1 基因对多种抗真菌药物敏感性的影响。结果显示，ADH1 基因缺失后，菌株对多种抗真菌药物的敏感性均无明显变化。
3、第三部分通过一系列致病力相关实验从不同层面考察了 ADH1 基因对白念珠菌致病力的影响。结果显示，ADH1 基因缺失后，菌株的菌丝形成能力和生物膜形成能力均减弱，体外粘附能力和细胞表面疏水性降低，致病力特异性基因表达水平下调，对小鼠、秀丽隐杆线虫和蜡螟的体内致病力亦减弱，以上实验均证实 ADH1 基因缺失可显著减弱白念珠菌致病力。
4、第四部分选择实验常用的检测细胞线粒体能量代谢的指标，初步考察了 ADH1基因对白念珠菌线粒体能量代谢的影响。结果显示，ADH1 基因缺失后，菌株线粒体膜电位水平降低，细胞内 ATP 含量减少，细胞内源性 ROS 增多，因此，我们初步推测 ADH1基因对白念珠菌线粒体氧化呼吸有明显影响。综上所述，本课题一方面完善了前期实验对 ADH1 基因影响菌株对药物敏感性的推测，虽然实验结果与预期不符，但另一方面，我们在阐明 ADH1 基因影响白念珠菌致病机制方面进行了深入全面的研究，同时初步探索了基因敲除后细胞内线粒体氧化呼吸的影响。由于白念珠菌（以及其他真菌）的 ADH1 基因具有显著不同于哺乳动物的特异性结构和功能[121]，这为筛选抗真菌药物作用的新靶点提供了理论基础。本项目的完成将为今后的相关研究提供重要的思路和线索。
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参考文献（略）