前言
研究现状、成果
（一）组蛋白甲基化修饰与 NK 细胞功能
NK 细胞最初被认为在哺乳动物免疫系统中发挥了重要的作用。它可以在不经过预敏的前提下，非特异性识别并杀伤病原体感染的细胞或者肿瘤细胞。此外，研究人员还发现 NK 细胞可以通过分泌一系列细胞因子和趋化因子参与免疫调控[1-3]。在靶细胞识别过程中，NK 细胞获得激活信号并经历了一系列被深入研究的细胞生物学过程，包括胞外钙离子内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触的部分形成免疫突触。随后，细胞毒颗粒（穿孔素和颗粒酶）与微管组织中心（MTOC）汇聚，并一起迁移到免疫突触。与此同时，胞浆中的钙离子感应器calmodulin （CaM）绑定到多种酶和通道，并最终激活其分子功能。磷酸酶calcineurin 是 CaM 的众多靶点之一，calcineurin 可以使 NFAT 去磷酸化并诱导其入核，入核后的 NFAT 参与转录调控，影响一些细胞因子和趋化因子的表达。最终，效应分子（细胞因子和趋化因子）和毒性颗粒（穿孔素和颗粒酶）分别通过不同的方式被运输和分泌，并最终执行其功能[4-7]。总而言之，NK 细胞被激活转变成为一个完全不同的细胞状态，获得了杀伤靶细胞和分泌效应分子的能力。1975 年，科学家 Herberman 最初观察到小鼠的一种淋巴细胞亚型（NK 细胞）可以自发的杀死同种异体的肿瘤细胞[8, 9]。从那时开始，很多科学家投入大量的精力物力研究 NK 细胞被靶细胞激活的过程，包括激活性受体和抑制性受体的平衡、信号通路传导、钙离子内流、免疫突触形成、毒性颗粒极化和最终的脱颗粒过程。然而，NK 细胞在激活的过程中其核内的染色质的修饰状态及结构是否发生变化？在真核细胞中，染色质修饰状态的变化可以直接导致基因表达水平的改变[10]。组蛋白的翻译后修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化等[11, 12]。这些修饰可以通过招募其他调控因子或改变染色质结构，进而调控基因的表达[11]。因此，维持组蛋白的翻译后修饰在稳态和动态的平衡，对基因的表达调控起到重要的作用。而且，这些修饰状态在细胞的发育或对微环境产生应激反应等一系列生物学过程中发挥重要的作用[11-13]。Fernández 等人报道，在CD4+T 细胞中，可以观察到 NKG2D 启动子区 DNA 的甲基化信号；而在 CD8+T细胞和 NK 细胞中，NKG2D 启动子区没有 DNA 甲基化信号，但可以观察到H3K9ac 的修饰。用组蛋白乙酰化酶抑制剂处理 NK 细胞，可以下调 NKG2D 的表达，进而抑制其杀伤功能，提示组蛋白修饰状态与 NK 细胞的功能密切相关。[14]。Zhao 等人报道，组蛋白去甲基化酶 Kdm5a 可以与 p50 相互作用，结合到细胞因子信号抑制蛋白 Socs1 的启动子区，调控 Socs1 的表达，并最终通过调控IFN-γ 的表达参与免疫调控[15]。众所周知，组蛋白修饰具备准确性、复杂性和可逆性等特点，是潜在的用药靶点。基于以上研究和结论，我们有理由相信，进一步研究组蛋白修饰状态与 NK 细胞活性的关系，可能为调控 NK 细胞的杀伤活性和免疫调控功能提供新的思路。
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（二）组蛋白甲基化酶 EZH2 与钙离子信号
外周免疫系统细胞中钙离子内流的机制通常依赖于钙池调控的钙离子内流（SOCE）[16, 17]。免疫细胞受体通过识别特异性配体起始激活信号，激活 Src、Syk/ZAP70 和 Tec/Btk 家族激酶，磷酸化并激活磷脂酶 C，磷脂酶 C 水解质膜上的PIP2，产生第二信使 IP3和甘油二酯[18, 19]。IP3与内质网膜上的 IP3 受体（IP3R）结合，使内质网将储存的钙离子释放到胞浆[18, 19]。在内质网的内腔中，存在一个钙离子传感器STIM，可以通过其N端钙离子绑定EF-hand识别钙离子浓度[20]。当其感知到内质网内钙离子外排后，形成多聚体，移动到内质网与质膜交界处，激活位于细胞膜上的钙离子通道 ORAI，使钙离子由胞外流向胞内，进一步调高胞浆中游离钙离子的浓度[18, 20, 21]。很多课题组多年来致力于研究钙离子信号在免疫系统中各种细胞的功能、作用。钙离子信号分为短期（瞬间）信号和长期（持续）信号。从短期来看，CTL 细胞需要钙离子进入胞浆作为第二信使，启动其脱颗粒功能，以杀死被感染的细胞，在 NK 细胞和肥大细胞杀伤肿瘤细胞的过程中，也观察到了相同的机制；从长期来看，T 细胞和 NK 细胞的增殖和细胞因子的产生，需要钙离子持续的进入细胞，提供低水平的钙离子信号[22-24]。B细胞分化成为浆细胞、na ve T 细胞分化为 Th1、Th2 和 Th17 效应细胞也需要细胞中持续的钙离子信号[25-27]。这些过程通常依赖于转录因子 NFAT。NFAT 在静息状态下的免疫细胞中处于磷酸化状态，游离在胞浆中。当细胞内钙离子信号升高，钙离子激活 CaM 依赖的磷酸酶 calcineurin，NFAT 被去磷酸化后进入细胞核，调控上述过程。在效应 T 细胞杀伤靶细胞的过程中，钙离子信号对于免疫突触的形成不是必须的，因为 actin 可以在没有钙离子的环境中发生重排[27]。然而，细胞毒性颗粒的极化过程需要钙离子信号的参与[28]。T 细胞中的线粒体移动需要较高的钙离子信号水平，这个信号需要内质网中储存的钙离子向胞浆中外流和细胞外部钙离子向胞浆中内流的叠加效应。因此，当 ORAI 信号被完全破坏后，T 细胞中的线粒体不能顺利的移动到免疫突触，进而导致毒性颗粒极化过程受到影响[18]。然而，通过分析一个 ORAI1 缺陷患者的 NK 细胞发现，该患者的NK 细胞激活性受体和抑制性受体的表达正常、穿孔素和颗粒酶表达正常、免疫突触和毒性颗粒的极化过程也是正常的；ORAI1 缺陷只影响了 NK 细胞的脱颗粒过程[29]。这说明钙离子可能只通过调控脱颗粒过程影响 NK 细胞的杀伤能力。
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一、NK 细胞激活过程中染色质修饰状态发生变化
近年来研究表明组蛋白修饰酶调控的组蛋白共价修饰在很多生物学过程（包括免疫调控过程）中发挥至关重要的作用。然而，在 NK 细胞被激活或识别靶细胞的过程中，其细胞核内染色质的结构和状态的变化却鲜有研究。在这一部分中，我们通过综合分析一套表达谱芯片数据和两套 ChIP-seq 数据，研究 NK细胞在被激活的过程中其组蛋白甲基化修饰状态的变化。用一系列特异于催化H3K4 和 H3K27 修饰酶的小分子抑制剂处理 NK 细胞以改变 NK 细胞甲基化修饰状态，研究 NK 细胞的脱颗粒水平，以及 IFN-γ 和 TNF-α 的表达。以期进一步分析组蛋白甲基化修饰状态对 NK 细胞激活的影响。
1.1 对象和方法
1.1.1 细胞、质粒和小鼠
NK92MI (CRL-2408)细胞系购买于 American Type Culture Collection (ATCC)公司。
1.1.2 主要试剂
1) 胎牛血清：购自 Gibco 公司2) 马血清：购自 Gibco 公司3) α-MEM 培养基：购自 Gibco 公司4) 叶酸：购自 Sigma-Aldrich 公司5) 肌醇：购自 Sigma-Aldrich 公司6) β-巯基乙醇：购自 Invitrogen 公司7) 双抗（Penicillin-Streptomycin）：购自 Hyclone 公司8) 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：购自 Sigma 公司9) 蛋白酶抑制剂（protease inhibitor cocktail）：购自罗氏公司10) BCA 蛋白定量试剂盒：购自 Pierce 公司11) 脱脂奶粉（skim milk powder）：购自 BD 公司12) 丙烯酰胺（Acrylamide, Acr）：购自索莱宝公司13) N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine)：购自索莱宝公司14) 过硫酸铵（Ammonium persulfate, AP）：购自 Sigma-Aldrich 公司
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1.2 结果
为了研究 NK 细胞在被激活前后，基因整体水平上的表达变化，我们在 GEO数据库中下载并分析了一套表达谱芯片数据[56]。在这套数据中，人类外周血 NK细胞与 K562 靶细胞共同孵育以激活 NK 细胞，刺激四小时后所有细胞与anti-CD107 抗体孵育，CD107 阳性 NK 细胞为 activated-NK 细胞，CD107 阴性NK 细胞为 resting-NK 细胞，随后流式细胞仪分别分选出 activated-NK 细胞和resting-NK 细胞，提取 mRNA，逆转录，最后用表达谱芯片检测两种细胞中 mRNA的总体表达水平。利用 R 编程语言的 limma 函数包，对 mRNA 在 activated-NK细胞和 resting-NK 细胞中的表达值进行 t 检验。与 resting-NK 细胞相比，activated-NK 细胞中有 777 个基因的表达被上调，有 551 个基因的表达被下调（|logFC|＞1 and P value＜0.05）（图 1.1A）。将所有差异表达基因上传到 DAVID 在线数据库进行 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信号通路分析，结果发现大多数富集的信号通路与免疫反应相关，包括 Cytokine-cytokinereceptor interaction, Natural killer cell mediated cytotoxicity 和 T/B cell receptorsignaling pathway（图 1.1B）。我们还注意到，大部分被富集的基因，都是在 NK细胞激活的过程中表达上调（图 1.1B）。随后，我们将注意力放到免疫相关的基因上，我们发现包括细胞表面激活性受体、抑制性受体、效应分子、细胞因子和趋化因子及其受体的表达都发生变化，而且大多数基因的表达被上调。与此同时，我们还发现很多转录因子、组蛋白甲基化酶和组蛋白去甲基化酶在 NK 细胞被激活后表达发生变化（图1.1C）。这些数据说明，NK 细胞在被激活的过程中发生了很大的转变；而参与转录调控的转录因子、组蛋白甲基化酶和组蛋白去甲基化酶可能在这个转变过程中起着较大的作用。
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三、Ezh2 调控小鼠 NK 细胞的终端成熟与抗肿瘤活性....60
3.1 对象和方法....... 60
3.1.1 细胞、质粒和小鼠..... 60
3.1.2 主要试剂............ 60
3.1.3 主要溶液、缓冲液和培养基....... 60
3.1.4 主要仪器和设备......... 61
3.1.5 实验方法及流程......... 61
3.2 结果.......... 63
3.2.1 mEzh2 条件敲除小鼠 NK 细胞中 mEzh2 表达显著降低........ 63
3.2.2 mEzh2 条件敲除小鼠中 NK 细胞增多.......... 64
3.2.3 mEzh2 调控 NK 细胞的终端成熟......... 65
3.2.4 mEzh2 缺陷促进 IFN-γ 的表达 .... 66
3.2.5 mEzh2 条件敲除小鼠具备更强的抗肿瘤能力....... 67
3.3 讨论.......... 68
3.4 小结.......... 70
三、Ezh2 调控小鼠 NK 细胞的终端成熟与抗肿瘤活性
在 NK 细胞从淋巴样祖细胞分化到成熟 NK 细胞这个过程中，由一系列内部因素（转录因子或信号通路分子等）和外部因素（细胞因子或趋化因子等）调控这个过程。我们实验室的前期研究发现，在小鼠造血干细胞中敲除组蛋白甲基化酶 mEzh2（mouse Ezh2），可以观察到小鼠骨髓、肝和脾中成熟 NK 细胞的绝对数和百分比被显著上调。而且基因芯片结果发现，mEzh2 敲除的 NK 细胞中，促进 NK 细胞后期成熟的转录因子 Tox 的表达被显著上调。因此，我们怀疑组蛋白甲基化酶 mEzh2 可以调控小鼠 NK 细胞的终端成熟。基于以上理由，我们用 mEzh2fl/fl小鼠与 Ncr1iCre小鼠杂交，繁殖特异于 NK 细胞的 mEzh2 条件敲除小鼠，旨在研究 mEzh2 与 NK 细胞晚期发育和抗肿瘤能力之间的关系。首先进行消毒准备工作，生物安全柜紫外消毒 30min，并将所有的实验用品放入生物安全柜中，实验者也必须进行严格的无菌操作。注射肿瘤的仪器用专用的鼠尾静脉注射仪，注射器用胰岛素注射器。首先将小鼠放入小鼠固定器中，并将固定器安装好，将小鼠的尾巴至于汞灯处，以便观察的小鼠尾部的静脉，固定好小鼠以后，将调整好的黑色素瘤细胞注射进鼠尾，注射过程中感到注射没有明显阻力，并且当将针头拔出来时，发现有明显回血，注射完以后，用 75%酒精棉球压住鼠尾的针孔处大约 2 分钟左右，防止继续流血和感染。2 分钟后，如果血液不在回流，则将小鼠放回鼠笼。2 周后，进行解剖实验，取出肺脏进行实验。
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结论
1．本课题首先通过高通量数据分析研究 NK 细胞在被激活的过程中其细胞核内组蛋白甲基化修饰状态的变化。筛选出一系列组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶在 NK 细胞激活前后表达发生变化，而且很多功能相关基因的启动子区被H3K4me3 和 H3K27me3 同时修饰，处于“poised”状态。随后，利用 NK 细胞的脱颗粒水平，以及 IFN-γ 和 TNF-α 的表达作为 NK 细胞的功能标志物，发现组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶小分子抑制剂 UNC1999、OG-L002 和 MM102 可能提高 NK 细胞毒性，为调控 NK 细胞毒性和免疫调节能力提供了新的思路。
2．基于高通量数据分析以及本实验室前期工作发现，我们进一步分析组蛋白甲基化酶 EZH2 与 NK 细胞脱颗粒功能的关系。研究发现，静息状态下的 NK 细胞中钙离子通道PKD2的启动子区被H3K4me3和H3K27me3同时修饰，抑制EZH2的表达或酶活性，可以改变钙离子通道 PKD2 启动子区的甲基化修饰状态，从而上调 PKD2 的表达水平，进而上调 NK 细胞内的钙离子信号，导致 NK 细胞在短时间内释放大量毒性颗粒到很少的靶细胞，最终表现为杀伤能力短时间内下调。
3．为了进一步研究组蛋白甲基化酶 Ezh2 在小鼠 NK 细胞中的功能，我们用mEzh2fl/fl小鼠与Ncr1iCre小鼠杂交，繁殖特异于NK细胞的mEzh2条件敲除小鼠，结果发现 mEzh2 条件敲除小鼠中 NK 细胞在脾、骨髓和淋巴结中的绝对数和百分比均有不同程度的上调，与此同时，mEzh2 条件敲除小鼠的 NK 细胞在被激活后表达更高的 IFN-γ，尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞 B16F10，观察到 mEzh2条件敲除小鼠肺部转移结节显著少于对照组小鼠，提示 mEzh2 不仅可以调控小鼠 NK 细胞的早期分化，而且参与 NK 细胞的终端成熟和抗肿瘤能力。
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参考文献（略）