第一部分 综述部分
1 寄生虫分类
对寄生虫种类的进行鉴定，这有利于掌握寄生虫病的流行病学和病原学等资料，并且可以为寄生虫病的防治工作积累相关数据。以前对寄生虫的分类主要使用传统的分类方法，例如形态、种源等。但该方法缺点日益明显，对于一些形态相似的寄生虫很难正确反映实际情况。随着科技的不断发展，各种分子学技术日益成熟，尤其是分子生物学技术的应用越发广泛（谢明权等，2003）。
1.1 传统分类鉴定
寄生虫的原来分类手段，主要是按照其形态学、宿主及生活史等特性来区分的。对于形态学分类，主要是靠人体肉眼及显微镜观察寄生虫虫体和器官的位置、大小及形态，或者根据其外部构成、微小及内部构造、宿主及寄生部位等重要特征，也可以直接进行种类鉴定。该方法比较容易，且仪器设备简单，故对寄生虫种类分类和鉴定来说仍然是不可或缺的一种分类方法，尤其对从事临床工作的兽医学者来说应用极其广泛（沈杰，2003）。虽然传统分类方法简单、方便，但其分类标准并无统一的指标，不能成为寄生虫分类的准确依据，尤其对一些相似度较高的种属来说，难以分类。此外，在用肉眼进行器官观察或样品处理时，特别容易受到虫体位置等客观因素的影响，给虫体的分离、鉴定造成极大困扰。
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1.2 分子鉴定
在当今时代，分子技术快速发展并完善，逐渐克服了传统的分类方法对部分寄生虫分类的难题。目前，多种现代分子学技术已经广泛得到应用（McManus andBowles, 1997），该种方法是以蛋白质、核酸、染色体为材料，运用免疫技术、同工酶电泳技术、DNA 杂交、分子细胞学技术、测序及种群基因结构分析等技术进行对比鉴定。当前，在寄生虫分类判定上进展较快的 PCR 方法具有快速、简便且信息量较为丰富，关键技术有 PCR-RFLP、RAPD 等。
1.2.1 PCR-RFLPPCR
连接的限制性片断长度多态性（polymerase chain reaction linked restrictionfragment length polymorphism, PCR-RFLP）是采用 PCR 技术进行扩增出特定的 DN A序列，下一步再进行酶切、电泳将条带分离，得到多态性限制性片段，观察其大小并断定不一样基因特异性。其基本原理就是利用为特异性的引物扩增某一序列，将产物用限制性内切酶消化，琼脂糖凝电泳分离，染色后观察测试。该方法简便、快速，且成本很低，适合于多种虫种的识别，尤其适用于多虫种存在同一地区的情况（杨立军和周本江，2010）。近些年 PCR-RFLP 技术已经广泛应用于鉴定寄生虫的试验，González 等人利用该种方法通过对 HDP2 基因片段的分析分离出了猪带绦虫、亚洲带绦虫和牛带绦虫（González et al., 2002 and 2004）。张朝云等人通过对绦虫 rDNA-ITS1 片段的分析进行 PCR-RFLP 分析，证明了都匀、江株、台湾和大理牛带绦虫的联系（张朝云等，2005 和 2006）。蔺东等人运用该方法鉴别出了不同种蛔虫（蔺东等，2002）。Gasser对 7 种带科绦虫核糖体（ITS2）进行 PCR-RFLP 分析，揭示了 ITS2-PCR-RFLP 在分子学研究等上的作用（Gasser et al., 1995）。Somers 等人使用 PCR-RFLP 方法区别并阐述了猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫的 12S rRNA 片段（Somer et al., 2007）。
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2 蛔虫的研究进展
猪肉在农村经济的发展等方面具有重要地位。尤其是作为养猪大国，养猪业已逐渐为我国经济的重要支柱（赵毅和汪勇，2014）。可怕的是，动物寄生虫病的广泛流行已经严重阻碍了我国经济效益（杨昌兰，2012）。经学者研究发现，猪体内主要的寄生虫有猪蛔虫、猪毛尾线虫、猪囊尾蚴、棘球蚴、细颈囊尾蚴等，而蛔虫感染强度最大，高达 80%（徐鹏等，2010；罗厚强等，2016）。
2.1 虫体形态特征和生活史
猪蛔虫病（Ascaridasis）是由属于线虫纲（Nematoda）蛔目（Ascaridata）蛔科（Ascaridae）蛔属（Ascaris）的猪蛔虫（Ascaris suum）引起的常见寄生虫疾病。成虫体型较长，可达 25 cm，存在于猪的小肠中（李国清，2006；邹勇等，2016）。由于成虫活着时含有宿主血液，虫体主要呈血色或淡黄色，死后转变成白色。该虫体两头细，中间粗，且为圆柱形。雄性蛔虫头端含有唇片，尾部长有钩状弯曲。无引器。雌性成虫体长达 35 cm，宽约 0. 5 cm。其尾部较雄性钝圆。交配后的受精卵呈椭圆形，卵壳由脂质层、几丁质层和蛋白质层三层组成，而未受精的卵细胞比受精卵薄，且无规则（汪明，2003；邹勇，2016）。Weise 曾对猪蛔虫形态用电子扫描显微镜进行观察，发现猪蛔虫镜唇中长有交错排列的圆锥状或矩形小齿（Weise et al.,1973）。李根茂等人首次对蛔虫卵的组织进行染色观察，为猪蛔虫的进一步研究提供理论学依据（李根茂等，2004）。然而，对蛔虫生殖器官的形态学研究颇为稀少，值得参考的国内外文献较少，因此对蛔虫的形态学观察及研究需要进一步深入。蛔虫的整个发育阶段无需中间宿主，因此可分为三个时期：虫卵期、幼虫期和成虫期（图 1-1、图 1-2）。刚产出的卵随着粪便排出进行发育。发育成熟后要通过蜕皮变成具有感染性的幼虫卵。幼虫卵被猪食入体内后在肠道内进行发育并逐步孵化出来幼虫，部分幼虫会移至盲肠及结肠，穿过肠壁进入血液循环，到达肝脏，继续移行至肺脏，最终在第五期时发育为成虫，共经 5 期幼虫期，4 次蜕皮（Douvres etal., 1969；曹玉娟等，2016）。有研究曾表明猪蛔虫卵在不适宜的温度下发育，可能会出现停滞甚至死亡（陈宁等，2009）。
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2.2 流行病学
作为一种土源性线虫，猪蛔虫在自然界中具有较高的感染率，流行甚广。其流行特点与饲养管理状况等紧密相关，饲料管理越差的猪场本病发生越频繁；猪蛔虫的感染最易发生在 3-5 月龄的仔猪，危害严重（Roepstorff et al.,1999; Ronquist andHuelsenbeck, 2003）。蛔虫之所以有较强的感染力，是因为虫卵的抵抗力强，生活史简单且繁殖能力超强，因此，虫卵能够长期存活，增加了幼虫的存活积累。但蛔虫卵亦受到宿主荷虫量的影响，二者之间成负相关，当荷虫量较多时，虫卵数量就会呈下降趋势( Sinniah and Subramaniam,1991；曹玉娟等，2016)。
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2.3 临床症状
猪蛔虫的临床症状和病原体的成长阶段有关，既幼虫和成虫的症状是不同的。感染蛔虫的病猪呈现沉郁、食欲减退、黄疸、体温升高、被毛粗乱、呕吐与腹泻、咳嗽及营养不良等症状，严重者导致停止发育直至死亡，尤其以仔猪多见。当幼虫进入血液循环穿过肺脏时，可能会引起肺出血、肺炎等严重症状（Bree et al., 2007）；至肝脏时，肝组织变性坏死并形成蛔虫斑（Perez et al., 2001），此时还会导致白细胞增加，同时出现神经症状等（Hadju et al.,1996; Crompton, 2001）。当猪蛔虫的成虫大量聚集在小肠时，会严重堵塞肠腔，并夺取营养物质，扰乱机体的消化功能，引起病猪消瘦，变为僵猪，甚至引起猪群大量死亡，对养猪业危害极大（Kipper et al., 2011;Knecht et al., 2011）。
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3 试验结果..... 56
3.1 藏猪蛔虫与细颈囊尾蚴线粒体基因组测序结果....... 56
3.2 线粒体基因组组分分析 ...... 58
3.3 两种寄生虫线粒体基因 A+T 含量 ..........60
3.4 两种寄生虫线粒体基因对应的氨基酸序列 ......62
3.5 两种寄生虫线粒体基因密码子偏好性....62
3.6 线粒体基因功能分析...........66
3.7 线粒体基因进化分析...........67
4 分析与讨论 ...........68
第四章 藏猪蛔虫、细颈囊尾蚴线粒体基因组序列测定与分析
摘要：本研究对藏猪蛔虫、细颈囊尾蚴进行线粒体 DNA 提取、建库和测序、功能注释和生物信息学分析。结果表明：猪蛔虫线粒体基因组大小为 14128 bp，编码基因 12 个（cox1-3, nad1-6, nad4L, atp6，cytb）、rRNA2 个（rrnL、rrnS）、tRNA35 个；细颈囊尾蚴线粒体基因组大小为 13607kb，编码基因 12 个（cox1-3, nad1-6, nad4L,atp6，cytb）、rRNA2 个（rrnL、rrnS）、tRNA 22 个。猪蛔虫、细颈囊尾蚴线粒体基因碱基 A、T 含量明显高于 C、G 含量，分别为 71.74%和 70.90%。猪蛔虫、细颈囊尾蚴线粒体基因密码子分别为 4385（不含终止密码子 304 个）和 4194 个（不含终止密码子 341 个）。两者密码子种类均为 63 个，TTT 使用最多，分别为 15.51%和10.44%；蛔虫最少的为 CAA（0.05%）、CGC（0.05%），细颈囊尾蚴最少的为 CGC（0.05%）。均翻译 20 种氨基酸，猪蛔虫苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸比例最高，为17.13%、16.03%、10.86%；细颈囊尾蚴为亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸比例最高，为16.48%、11.76%、11.06%。猪蛔虫氨基酸比例最低的为谷氨酰胺（0.73%）、组氨酸（0.62%）；细颈囊尾蚴氨基酸比例最低的为谷氨酰胺（1.29%）、色氨酸（1.67%）、丙氨酸（1.81%）。进化分析结果表明：藏猪蛔虫与人蛔虫（NC-016198.1）同源性高达99%；与X54253.1同源性高达99%；与中国湛江分离虫体（登录号为HQ704901.1）同源性为 98%。该结果与之前报道的人蛔虫与猪蛔虫高度同源结果一致，进一步证实了二者可能为同一种虫体。细颈囊尾蚴与序列号 GQ228819.1、FJ518620.1 同源性均高达 99%。通过开展藏猪蛔虫、细颈囊尾蚴线粒体基因组测序，对于了解藏猪寄生虫的分离鉴定、进化分析、种内遗传变异情况，有效地防治藏猪寄生虫病并提供重要的参考数据。
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结论
本研究采用寄生虫完全剖检法、粪便虫卵检查法、PCR 扩增和序列分析，对藏猪消化道寄生虫进行流行病调查，并对藏猪 2 种常见消化道寄生虫：蛔虫和细颈囊尾蚴线粒体部分基因序列展开了研究，为该地区寄生虫的流行情况和分类鉴定提供分子标记。同时，还对藏猪蛔虫、细颈囊尾蚴线粒体全基因组全序列进行了测定和分析，丰富了线虫和绦虫寄生虫基因组学研究内容，并为相关寄生虫病的防控提供相关分子资料。现将研究内容具体总结如下：
1. 采用寄生虫学完全剖检法、粪便虫卵检查法，112 头屠宰藏猪、73 份粪便进行寄生虫病流行情况调查。调查结果说明，林芝地区藏猪胃肠道寄生虫感染普遍，感染率普遍较高。由于藏猪的活动范围广，不能有效的进行管理和驱虫工作，首先应该对该地区其他动物进行进去定期驱虫，减少寄生虫的中间宿主数量，以期达到减少污染的目的。此外，交替使用牧场，切断传播途径，防止动物间的交叉感染。另外，通过加强兽医卫生防治措施，定期培训基层兽医工作者和广大农牧民，宣传和培训相关寄生虫病的科学防治知识，提高寄生虫病的防治意识，从而减少人畜共患寄生虫病的发生。
2.运用 PCR 方法，成功扩增出 nad1（370 bp）、cox1（450 bp）和 cox2（600 bp）基因序列，并以此鉴定藏猪蛔虫的种类。结果显示：藏猪蛔虫的 nad1、cox1 和 cox2序列均与猪蛔虫（登录号：X54253.1）相似性为 99%。本研究是首次通过藏猪蛔虫三个线粒体基因片段 nad1、cox1、cox2 进行分离、鉴定和分子标记。
3. 本研究以西藏林芝地区屠宰藏猪体内分离出来的细颈囊尾蚴为研究对象，用ELISA 和 PCR 方法，成功扩增藏猪细颈囊尾蚴的 cox2 基因序列，以鉴定藏猪细颈囊尾蚴的种类。结果显示：本次分离到细颈囊尾蚴株与甘肃、青海和四川分离株具有很大的相似性。本研究是首次通过对藏猪细颈囊尾蚴进行流行病学调查和 cox2 基因进行分离和鉴定，旨在为西藏地区藏猪细颈囊尾蚴的防治提供流行病学和分子生物学数据。
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参考文献（略）