1 文献综述
1.1 红斑丹毒丝菌研究进展
鸽子和小鼠对红斑丹毒丝菌敏感性最高，是常用的动物模型；豚鼠和鸡则不敏感，常用来致弱。红斑丹毒丝菌造成人类感染的主要表现是类丹毒疾病，属于一种职业病，对于从业者构成危害。斑丹毒丝菌是一种兼性厌氧型的小革兰氏阳性菌，菌体细长（长 0.8-2.0μm，宽 0.2-0.4μm），单个或成链状存在[1-3]。红斑丹毒丝菌在自然界广泛存在，目前发现的宿主已经达到 50 种以上，可以从多种野生的和家养的动物体内分离得到。这些动物除了哺乳动物外，还包括鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类[2]。多位点序列分型表明 165 株临床分离株被划分为 72 个分子型[4]；83 株红斑丹毒丝菌的全基因组分析则表明同源重组对红斑丹毒丝菌进行了广泛的重塑[5]。所以红斑丹毒丝菌被认为是一种弱克隆种[4, 5]。依据细胞壁耐热抗原，该菌具有 1a, 1b, 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 15,16, 17, 19, 21 and N 共 15 个血清型[2]。其中 1a，1b 和 2 型菌株的毒力强，危害也最大[1, 3]。猪丹毒病在世界范围内发生，最具有经济重要性。红斑丹毒丝菌因造成猪丹毒而出名，猪丹毒杆菌是该菌的俗称[1, 3]。猪丹毒是一个老病，上个世纪在全球兽医界都是一个重要的病[2]，我国曾经将猪瘟、猪丹毒、猪肺疫列为三大猪场疫病[6]。后来由于优良疫苗的出现和合理的用药，猪丹毒自 90 年代开始呈现散发。但是 2010 年以来，猪丹毒发病呈现逐年上升趋势，且主要为规模化猪场发病，损失巨大（图 1）[7]。红斑丹毒丝菌主要通过污染的饲料和水感染易感猪，也可以通过伤口感染猪[1]。猪丹毒主要表现为猪的败血症、皮炎、心内膜炎和多发性关节炎等，给养猪业带来巨大经济损失。急性猪丹毒的特征是败血症、皮肤损害和随之而来的急性死亡[3]。在组织病理水平上，猪丹毒病理全身各组织都可以观察到血管病变。在急性猪丹毒早期既可以观察到多处器官的毛细血管和微静脉都发生病变.
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1.2 红斑丹毒丝菌毒力因子和致病机制
现在已知红斑丹毒丝菌不同菌株毒力差别非常大。红斑丹毒丝菌的致病机制还没有很好的阐释。至今为止也没有发现与该菌有关的任何毒素[17]。到目前为止已经鉴定出了几个候选的毒力因子，包括神经氨酸酶、透明质酸酶、荚膜、RspA、RspB、SpaA 等[18-21]。但是对这些候选毒力因子的研究，不同的研究结果并不一致甚至相互冲突[22, 23]。还没有发现任何一个候选的毒力因子在致病机制中发挥关键作用。
1.2.1 已知的毒力因子和致病机制
1.2.1.1 神经氨酸酶
不同菌株具有不同的水平的神经氨酸酶，强毒株产生的神经氨酸酶量高，而弱毒株产生的量就比较低，对于一些非致病性的丹毒丝菌菌属的菌株来说则不产生神经氨酸酶[24]。通过强毒株和弱毒株的转录组和蛋白质组学比较发现弱毒株中神经氨酸酶的表达量下调[23]。神经氨酸酶的作用是降解唾液酸。唾液酸作为非还原残基广泛分布于真核细胞表面和糖蛋白表面。从宿主细胞上和重要糖蛋白上降解唾液酸可以满足病原菌的某些营养需求并导致宿主某些功能的丧失[25]。研究表明，唾液酸的释放与红斑丹毒丝菌粘附大鼠的血管内皮细胞密切相关[17]。经过神经氨酸酶处理后，红斑丹毒丝菌对于宿主细胞的粘附能力增强。研究也表明神经氨酸酶在红斑丹毒丝菌侵入宿主和扩散中发挥作用[24]。
1.2.1.2 透明质酸酶
透明质酸酶已经有报道[22]。透明质酸酶可以降解透明质酸，促进病原菌在宿主组织中的传播[22, 26]。但是其在红斑丹毒丝菌强弱毒菌株中的差别并不明显，研究也没有发现其与红斑丹毒丝菌致病性的必然联系[22, 26]。尽管有研究发现透明质酸功能缺失突变体的毒力下降了，但是同时也发现荚膜多糖丧失了。所以据推测，毒力下降可能是荚膜多糖丧失造成的[18].
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2 红斑丹毒丝菌致病性表型研究
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株、细胞系及培养条件
本研究使用了本地流行强毒株 SE38 株、弱毒菌株 G4T10 株和 GC42 株，这些菌株均由农业微生物学国家重点实验室保存并提供。本地流行强毒株 SE38 是本实验室于 2014 年湖北省武汉市某猪场分离，分离自发生急性猪丹毒死亡的猪体内[7]。已经通过 PCR 方法和 16SrRNA 测序确定其为猪丹毒，并且也使用小鼠致病性实验研究过其毒力[82]。这些菌株使用胰蛋白大豆肉汤（TSB）或者胰蛋白大豆琼脂（TSA）（BD, Franklin Lake, New Jersey, USA）添加 10%新生牛血清（Sijiqing, Hangzhou,Zhejiang, China）培养。猪髋动脉血管内皮细胞（Pig iliac arterial endothelial cells,PIECs）购自中国科学院上海细胞库。猪髋动脉血管内皮细胞使用 HycloneRPMI-1640 培养基(GE Healthcare, Logan, Utah, USA)添加 10%胎牛血清（TransGene,Beijing, China）进行培养。
2.1.2 小鼠致病性实验
所有实验动物的饲养和使用均在湖北省实验动物监督委员会的指导下进行。所有的操作规程已经获得华中农业大学实验动物监督委员会的批准。实验中我们尽一切努力减小实验动物遭受的痛苦。参考过去文献中报道的方法进行小鼠致病性实验，做少许修改[69]。45 只 C57/B6小鼠（购自华中农业大学实验动物中心）随机分成 9 组每组 5 只小鼠。各组分别每只皮下注射不同剂量（101/0.1ml, 104/0.1ml 和 107/0.1ml）的红斑丹毒丝菌，所以菌株（SE38，G4T10 和 GC42）均做上述处理然后连续观察 14 天，记录小鼠的发病和死亡情况。
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2. 2 结果
SE38 显示出较强的毒力，101CFU 菌量即可致死大部分小鼠（4/5），而 G4T10和 GC42 则表现出很弱的毒力，104CFU 攻毒没有出现死亡；当剂量达到 107才出现小鼠的死亡.两种细胞毒性检测方法均显示红斑丹毒丝菌对于猪髋动脉血管内皮细胞无明显的毒力作用。猪链球菌 SC19 株孵育猪血管内皮细胞后，上清中的 LDH 浓度逐渐升高，但是红斑丹毒丝菌强毒菌株和弱毒菌株孵育猪髋动脉血管内皮细胞后上清的LDH 并没有明显增加（图 8A）。与此实验相对应的 WST-1 检测也显示猪髋动脉血管内皮细胞线粒体酶的活性并没有因为孵育红斑丹毒丝菌而变化（图 8B）。当红斑丹毒丝菌与猪血浆或人纤溶酶原共孵育并经过尿激酶激活以后，红斑丹毒丝菌菌体就表现出了血浆纤维蛋白溶解酶的活性。由孵育猪血浆或者人纤维蛋白溶解酶原的红斑丹毒丝菌菌体、尿激酶、发色底物组成的混合物的光密度值明显高于缺少尿激酶或者纤溶酶原的阴性对照组 （图 9）。所以，实验结果表明红斑丹毒丝菌能够招募血浆纤维蛋白溶解酶原。
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3 GAPDH 等红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用研究........23
3.1 材料和方法......23
3.2 结果..........25
3.2.1 红斑丹毒丝菌致病性相关表面蛋白的筛选......25
3.2.2 蛋白的克隆、表达和纯化.......25
3.2.3 rGAPDH 的酶活性....27
3.2.4 表面定位检测.........27
3.2.5 重组表面蛋白对猪血管内皮细胞的粘附..........29
3.2.6 竞争粘附抑制实验..........30
3.2.7 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白结合活性....31
3.3 讨论..........32
4 GAPDH 等红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力研究............36
4.1 重组红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力........36
4.2 对 GAPDH 作为广谱疫苗的评估..........45
4.2.1 材料与方法....45
4.2.2 结果........46
4.2.3 讨论.......47
5 红斑丹毒丝菌疫苗弱和野毒菌株鉴别诊断方法的建立.........49
5.1 基于 SNP 区分猪丹毒疫苗株和野毒株的 PCR 方法的修正...........49
5.2 区分猪丹毒疫苗菌株和野生型菌株的双重 PCR 方法的建立.......54
5 红斑丹毒丝菌疫苗弱和野毒菌株鉴别诊断方法的建立
疫苗菌株和野生型菌株的鉴别诊断方法是动物疫病根除计划的关键技术基础，本研究发现了可用于鉴别红斑丹毒丝菌疫苗菌株和野生型菌株的的线索，进而建立起了鉴别诊断方法。
5.1 基于 SNP 区分猪丹毒疫苗株和野毒株的 PCR 方法的修正
在比较红斑丹毒丝菌弱毒疫苗株和本地流行强毒株 SE38 的基因组（未发表的数据）过程中我们并没有发现大片段的插入或缺失，二者的差别主要表现为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。恰在此时，日本学者建立了一种基于 SNP 的 PCR 方法来区分弱毒疫苗株和野毒株，我们以中国的疫苗株和野毒株作为研究对象，对该方法进行了评估，同时也对该方法进行了修正。使用细菌基因组提取试剂盒（Generay，Shanghai，China）提取红斑丹毒丝菌基因组。严格按照原始文献[66]中提出的方法进行扩增。50μl 体系中包含 50 ng 基因组DNA, 1 U DNA 聚合酶(KOD FX DNA Polymerase, TOYOBO, Osaka, Japan), 20 μMSNP 特异性引物（附录 A），各种 dNTP 均为 0.4mM。PCR 反应条件为 预变性 95°C5 min 进行 35 个循环的三步扩增：95°C 30 sec, 67°C 30 sec, and 72°C 60 sec。将上述 PCR 扩增体系中的 DNA 聚合酶替换成具有更高外切活性更高保真性的高保真酶（LA Taq Polymerase, Takara, Shiga, Japan）或者不具有把外切活性的普通DNA 聚合酶（rTaq DNA Polymerase, TOYOBO, Osaka, Japan），然后按照上述条件进行扩增，并跑胶对扩增结果进行比较。
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总结
红斑丹毒丝菌是造成动物丹毒病的病原体，所有动物丹毒病中猪丹毒的经济意义最大。2010 年以后猪丹毒开始抬头，发病数量逐年增加，给我国养猪业带来巨大经济损失。丹毒病同时也对火鸡养殖和养羊产业及野生动物保护造成威胁。红斑丹毒丝菌也是一种人兽共患病病原体，可以造成人类发生类丹毒等疾病，给密切接触者带来威胁。随着人们生活水平的提高，接触生鲜畜产品从而感染红斑丹毒丝菌的几率也在增大，不断增加的猪丹毒疫情更进一步增加了这一风险。但是红斑丹毒丝菌感染的致病机制仍然不很清楚，严重制约对于红斑丹毒丝菌感染的控制。本研究比较系统地研究了红斑丹毒丝菌的致病性表型，评估了 GAPDH 等 5 个红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用及其作为保护性抗原的潜质。依据工作中发现的线索修正或者建立了区分红斑丹毒丝菌弱毒疫苗菌株和野生感染型菌株的方法。取得了如下成果：
1. 比较系统地表征了红斑丹毒丝菌的致病性，发现了新的潜在致病机制。红斑丹毒丝菌感染发病机制的关键是其对血管内皮细胞的损伤。本研究结果发现：红斑丹毒丝菌可以直接粘附内皮细胞但是并不能直接损伤血管内皮细胞。它可能通过招募宿主的血浆纤维蛋白溶解酶原等宿主分子损伤血管内皮细胞。红斑丹毒丝菌也可能通过其抗吞噬和补体杀伤作用而在血管内皮细胞表面大量繁殖，从而引起过强的炎症反应造成内皮细胞的炎性损伤。红斑丹毒丝菌强毒菌株的免疫反应是 Th1 细胞调节的反应占优势，这就反映出了吞噬细胞的吞噬作用在宿主清除红斑丹毒丝菌过程中的关键作用。
2. 发现了 5 种潜在的红斑丹毒丝菌毒力因子。红斑丹毒丝菌感染发病过程中其表面蛋白发挥了重要作用。我们的研究结果表明四个表面蛋白（SpaA、CbpB、GAPDH、HP1472）发挥粘附素作用促进红斑丹毒丝菌粘附血管内皮细胞。四个表面蛋白（SpaA、CbpB、GAPDH、HP0728）在红斑丹毒丝菌招募宿主分子（血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白等）过程中发挥受体作用，这些被招募的宿主分子一方面可以促进红斑丹毒丝菌菌体的粘附作用，另一方面可以在降解纤维团块、侵入组织、损伤血管、炎症反应、免疫调节等方面发挥作用。
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参考文献（略）