第一章 文献综述
目前为止，狂犬病已成为致死率最高的传染病，发病后尚无有效的治愈方法。世界卫生组织（WHO）的数据显示，在全球范围内死亡人数已超过 59000 人/年，绝大部分病例位于非洲和亚洲的发展中国家（图 1-1）(World Health 2013, Fooks et al2014, Barkhouse et al 2015)，并且有超过 30 亿人因生活在狂犬病流行地区而受到该病的威胁。当前，我国狂犬病疫情仍然相当严峻，狂犬病发病数居世界第二位，仅次于印度，从 2004 年至 2013 年的 10 年间，中国大陆每年死于狂犬病的人数约在1500 至 3000 人之间(Yao et al 2015)。自 1996 年起的 14 年间，我国狂犬病疫情逐年回升，记录狂犬病病发地区不断扩大，除西藏和青海之外的省份共报告狂犬病 22060例，发病率总体呈现上升趋势，其中，广东、广西、贵州、湖南、湖北和江西是狂犬病病例累计最多的省份（自治区），占全国病例总数的 67.63%(Wu et al 2011)。目前，狂犬病依然是我国公共卫生的忧患之一。数据显示，95%的人狂犬病例均来自动物咬伤或抓伤，其主要的临床症状为亢奋、畏光、水和响动、流涎、延髓逐渐麻痹，病死前多脏器衰竭。美国、加拿大和欧洲西部等发达国家，通过扩大动物的免疫范围，已经有效控制了动物间的狂犬病，进一步限制了人间狂犬病。据相关文献报道，犬的免疫覆盖率达到 70%以上时，可以有效控制人间狂犬病(Lankester et al 2014)，因此，动物的免疫预防对于人类狂犬病的遏制具有重大意义。
自巴斯德首次制备狂犬病弱毒疫苗以来，全球的科研人员不断改进并研发出更加安全有效的人、兽用狂犬病疫苗。目前，用于宠物（犬、猫）的常规疫苗主要为灭活疫苗，但此类疫苗只有经过多次免疫接种才能提供持久的保护力，造成严重的经济负担，因而，目前尚难在发展中国家普遍开展和完善断绝传染源相关的防制措施。正因如此，在发展中国家，动物狂犬病的控制需要长期有效及廉价的疫苗。以下将就狂犬病及其预防以及 RABV 的特性进行综述。
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1.1 狂犬病的历史
Rabies 一词源于梵语“Rabbahs”意为“狂暴”。在希腊、罗马、中东以及中国的古老文献中，都曾出现过关于狂犬病的相关描述，最早关于狂犬病的记录可能远及公元前 2300 年古巴比伦国埃什努纳法典的记载（图 1-2）(Harrison. 1950)。从早期的零星记载中可见，本病在非洲、欧洲和亚洲已经以固定的形式至少存在了上千年，而近十个世纪来，关于狂犬病的记载已越来越详细，也越来越频繁。狂犬病的研究最先开始于 1804 年的科学年代，科学家 Zinke 发现收集的病狗唾液能够感染鸡和兔子。随后在 1813 年，两位法国科学家 Magendie 与 Breschet 用病人的唾液感染了狗，证实了该病可在人与动物身上引起极为相似的发病历程和临床症状，进一步确定唾液中含有病原体。此后 50 年间，医生对患病动物咬伤的患者束手无策，直到法国科学巨匠巴斯德的发现，从此促进了该病暴露前预防与暴露后治疗相关研究的发展。巴斯德发现发病动物的唾液、脑脊液与脑组织悬液会导致某种神经性疾病，并且大量病原体存活于中枢神经系统内。巴斯德早期的预防和治疗是通过渐次接种减毒疫苗的方式，他收集发病动物相关组织减毒后研制出该疫苗，但副反应强，第二代疫苗是安全性更高的灭活疫苗。从此，揭开了科学认识狂犬病治疗和预防的序幕。
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1.2 RABV 的分子生物学特征
通过分析 RABV 属核蛋白（Nucleoprotein, N）基因的进化树，Gould 等建议将 RABV 属分为 7 个基因型：1型为古典 RABV；拉各斯蝙蝠病毒为 2 型；莫科拉病毒为 3 型；杜文黑基病毒为 4型；1 型欧洲蝙蝠 RABV 为 5 型；2 型欧洲蝙蝠 RABV 为 6 型；澳大利亚蝙蝠 RABV为 7 型(Gould et al 1998)。目前，在我国获得的 RABV 毒株和生产使用的疫苗毒均为基因 1 型。Badrane 等根据 N 蛋白或跨膜糖蛋白（Glycoprotein, G）序列，将 7 个基因型分为两个遗传进化群，遗传谱系Ⅰ包括基因 1 型、基因 4 型、基因 5 型、基因 6 型和基因 7 型；遗传谱系Ⅱ包括基因 2 型和基因 3 型（图 1-3）(Badrane et al2001)。同一遗传进化群内的病毒所分泌的抗体可交叉产生免疫保护，如欧洲蝙蝠RABV 所产生的抗体，可以对 1、4、5、7 基因型的 RABV 产生保护，但是对 2、3基因型的 RABV 无效。
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1.3 RABV 的复制
RABV 本身缺乏复制所需要的酶系统，因此，只能由宿主细胞提供。其增殖的生命周期大致可以分为三个阶段（图 1-7）：第一阶段，①，RABV 与宿主细胞受体结合，以通过细胞膜胞饮作用进入宿主细胞，②，pH 调节病毒粒子包膜与宿主细胞内体膜融合；第二个阶段，③，核衣壳释放，病毒基因开始转录，④，基因组复制，⑤，蛋白合成；第三个阶段则是病毒成分装配、向出芽位点的运输和成熟病毒粒子释放的过程，进而开始新一轮感染。病毒脂质双分子层外侧镶嵌的 G 蛋白与宿主细胞的特异性受体相互作用，诱发病毒粒子发生胞吞(Etessami et al 2000)。前体状态的 G 蛋白移动至内质网上，在某些催化剂的作用下变成寡聚物，经过蛋白酶水解过程转换为亚稳定状态，此时，G蛋白的构象由于内涵体（Endosome）内较低的 pH 而显著改变，使其疏水基团趋向于宿主细胞膜，构象不稳定的 G 蛋白释放能量引导两种膜结构靠近，从而实现病毒囊膜与宿主细胞包膜融合，核衣壳被释放到细胞质中，病毒就完成了进入细胞的过程(Mas and Melero 2013)。RABV 的免疫逃逸与 G 蛋白相关，病毒从细胞膜包裹形成的囊泡进入宿主细胞后，为了不让宿主细胞的受体识别引发免疫监视，会把参与膜融合的 G 蛋白带回胞质内。因此，RABV 的 G 蛋白，既参与病毒的吸附和胞吞过程，又是病毒致病性的主要决定因素。
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第二章 研究目的和意义
通过佐剂延长体液免疫反应对长期高效的狂犬病疫苗的研发具有重大意义，然而，当前利用免疫记忆的相关机制调节狂犬病疫苗体液免疫发展的功能尚不清楚。鉴于 IL-7 在获得性免疫应答中对 T、B 细胞分化及维持的重要功能，本实验通过反向遗传技术构建了过表达 IL-7 的重组狂犬病疫苗 rLBNSE-IL7，在小鼠模型中检测其免疫原性和致病性。在确定外源基因 IL-7 在重组病毒基因组中的表达并不影响其体外生长特性后，探索 IL-7 的脑内表达对 rRABV 致病性的作用，并重点分析该致弱病毒与 Tfh 细胞、GC B 细胞以及与免疫记忆相关的长寿命 Bmem 和 PCs 之间的关系，以及 Tfh-GCs 反应对狂犬病疫苗初次免疫反应和再次免疫应答的影响。本研究首次发现 IL-7 能够促进 RABV 的免疫记忆，并为 IL-7 延长 RABV 体液免疫的相关作用机制提供理论依据，为新型、低毒、高效的狂犬病疫苗的研发提供新的思路，同时期望 rLBNSE-IL7 可以作为安全、长效的狂犬病疫苗的候选。
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第三章 材料和方法......32
3.1 实验材料 .............32
3.1.1 细胞.....32
3.1.2 质粒和病毒.............32
3.1.3 试剂和抗体.............32
3.1.4 实验动物.......33
3.1.5 实验仪器.......34
3.2 实验方法 .............34
第四章 结果与分析.....47
4.1 重组病毒的构建及体外活性鉴定............. 47
4.2 IL-7 的表达对 RABV 致病性的影响......... 52
4.2.1 rLBNSE-IL7 对成年小鼠致病性的影响 ....... 52
4.2.2 rLBNSE-IL7 对乳鼠致病性的影响 ..... 55
4.3 IL-7 的表达对 RABV 免疫原性的影响..... 574
第五章 讨论.....76
5.1 关于重组病毒的的体外表型特征............. 76
5.2 关于重组病毒的的致病性..... 77
5.3 关于重组病毒的的免疫原性........... 78
第五章 讨论
狂犬病是人畜共患神经性烈性传染病，一旦发病 100%死亡。当前，我国狂犬病发病人数居世界第二位，仅次于印度，近年来平均每年死于狂犬病的人数约为3000 人左右，并且 95%以上的病例源于动物感染，而通过加大动物免疫覆盖率可以有效控制人类狂犬病。从巴斯德首次制成狂犬病弱毒疫苗以来，全球不断研发出更加安全有效的人、兽用狂犬病疫苗。尽管国内用于宠物（犬、猫）的常规商品化疫苗已经广泛使用，但此类灭活疫苗只有经过多剂量接种才能提供长期有效的保护力，造成严重的经济负担，目前尚难在发展中国家给农村散养动物、流浪动物及野生动物实现更加全面的免疫覆盖以断绝传染源。因而，在发展中国家，动物狂犬病的控制需要价格低廉且长期有效的单剂量安全疫苗。来源于 SAD-B19 毒株的 rLBNSE 株为一致弱疫苗株，Faber 等将该毒株 G 蛋白上 194 位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333 位的精氨酸突变为谷氨酸之后，显著降低了其致病性，rLBNSE 株依然具有优良的免疫原性，北美已将其作为弱毒活疫苗用于动物免疫，一定程度上阻止了动物间狂犬病的传播(Faber et al 2007, Wen et al2011)。我们早先研究了表达免疫因子的 rRABV 的免疫原性，如将 MIP-1α、GM-CSF、CXCL13、IL-21 等细胞因子和趋化因子插入到 rLBNSE 株的基因组中，利用反向遗传操作技术拯救重组病毒，发现部分重组病毒可以在一定程度上导致病毒致病力下降，并通过成熟 DCs、Tfh 细胞和 GC B 细胞来促使机体迅速产生更高水平的 VNA，提高免疫保护率，为研发新型狂犬病疫苗开辟了新的思路(Zhao et al 2010, Wen et al2011, Zhou et al 2013, Zhou et al 2015, Zhang et al 2016)。但这些疫苗产生和维持抗体的时间相对较短，因此，在本人的博士论文中将探索免疫记忆的相关作用机制来构建更加持久高效的新型弱毒疫苗。
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结论
6.1 成功构建了重组病毒 rLBNSE-IL7，IL-7 的表达对重组病毒的体外生长特性没有显著影响。
6.2 重组病毒 rLBNSE-IL7 可在脑内表达 IL-7，并进一步减弱病毒的致病力。
6.3 重组病毒 rLBNSE-IL7 可增加淋巴结中 Tfh 细胞、GC B 细胞和长寿命 Bmem的数量，提高骨髓中长寿命 PCs 的比例。
6.4 重组病毒 rLBNSE-IL7 可诱导长期的初次免疫保护性反应以及迅速的再次免疫应答。
6.5 IL-7 可促进狂犬病病毒的免疫记忆。
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参考文献（略）