第 1 章 文献综述
1.1 伪狂犬病毒简介
伪狂犬病毒能感染多种哺乳动物引起发热、奇痒（猪除外）、脑脊髓炎等症状，给家猪养殖业造成巨大经济损失。1902 年，Aládar Aujeszky 首次发现该病毒，此后，学者陆续在牛、狗、猫中分离到该病毒。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科α 疱疹病毒亚科，病毒宿主范围广，复制周期短，可在感觉神经节中建立潜伏感染。PRV 病毒粒子为圆形，完整病毒粒子大小通常在 150-250 nm 之间，由四个部分组成（图 1-1）：中央核心处的病毒基因组 DNA，包裹基因组的衣壳，衣壳外的被膜以及最外层的囊膜。
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1.2 伪狂犬病病原学特征
PRV 侵入猪呼吸系统和神经系统，通过感染粘膜上皮细胞进入感觉神经末梢。PRV 感染的发病率和死亡率与感染猪的年龄、健康状态、病毒毒株、感染剂量等多种因素有关。PRV 最容易感染仔猪，诱发中枢神经感染症状，在成年猪中，PRV 只能引起呼吸系统疾病症状。在未断奶仔猪中，PRV 感染潜伏期为 2-4 天，感染仔猪先出现无精打采、发热、吃奶减少等临床症状，在发病 24 小时内逐渐出现发抖、口吐白沫、共济失调等中枢神经感染症状。感染仔猪可能会因为后腿瘫痪，有瘫坐地上、侧躺、跛行、绕圈转等行为特征，一旦出现中枢神经系统异常症状，发病猪将在 24-36 小时内因病毒性脑炎而死亡，死亡率为 100%。3-9 周龄的断奶仔猪感染 PRV 后虽然症状与未断奶仔猪相似，但是死亡率降低很多，3-4 周龄断奶仔猪死亡率为 50%。5-10 周龄断奶仔猪感染后神情倦怠、厌食，感染后 3-6 天体温升至 41-42℃，同时伴有打喷嚏、流鼻涕、咳嗽、呼吸困难等呼吸症状。呼吸症状出现后，猪体重显著下降，直接造成经济损失。感染5-10 天后症状逐渐减轻，随着发热与厌食症状的缓解，体重快速恢复。感染猪在发病期内如果受到仔细照料，死亡率可低至 10%。PRV 感染成年猪后也会引起呼吸症状，偶尔出现轻度肌肉无力到癫痫等不同程度的中枢神经系统症状。虽然发病率接近 100%，但死亡率只有 1-2%。成年猪感染后第 3-6 天体温升高至 41-42℃，出现无精打采、食欲不振、轻到中度呼吸症状等临床症状，并伴随打喷嚏、流鼻涕等鼻炎症状。呼吸系统疾病可能会随着咳嗽、呼吸困难而发展为肺炎。发病猪日渐消瘦，体重大幅降低，给生猪养殖业造成巨大经济损失。病猪一般在临床症状出现 6-10 天后恢复。怀孕中后期的妊娠母猪感染 PRV 后表现为流产、产死胎或木乃伊胎，PRV造成母猪不孕可能是由于病毒跨过胎盘影响子宫造成的。在PRV感染的猪场中，妊娠母猪生殖障碍的发生率约 20%。
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第 2 章 PRV Ea 株全基因组测序
2.1 前言
伪狂犬病病原伪狂犬病毒能在其天然宿主猪中引起生殖、神经和呼吸系统疾病，尽管在世界范围内多种灭活疫苗和弱毒疫苗被广泛使用，伪狂犬病在家猪和野猪中仍不时爆发 (Musante et al 2014; Masot et al 2017; Pomeranz et al 2005)。PRV 被认为是 α 疱疹病毒亚科的一种模式生物。包括 HSV-1、HSV-2、BHV-1、VZV 及 PRV 在内的 α 疱疹病毒能在宿主神经系统建立终身潜伏感染，是研究哺乳动物神经回路结构的有效工具 (Pomeranz et al 2005; Klupp et al 2004; Enquist2002a; Ekstrand et al 2008; Enquist 2002b; Szpara et al 2011)。20 世纪，包括匈牙利Kaplan 株、美国 Becker 株和中国 Ea 株在内的多株 PRV 毒株被分离鉴定，在多种 PRV gE 缺失疫苗的广泛应用下，伪狂犬病被有效控制 (Muller et al 2011; Yu etal 2016)。中国作为猪肉消费大国，PRV 一直被认为是养猪产业中的重要病原。伪狂犬病在国内的首次记录出现于 1948 年，并在上世纪八十年代广泛流行，造成大量怀孕母猪流产，包括 Ea 株在内的多个国内早期毒株从流产胎儿中分离得到 (陈焕春等 1998)。为控制 PRV 在国内的传播，匈牙利弱毒疫苗 PRV Bartha 于上世纪六十年代被引入中国 (Bartha 1961)，同时，一些基于 Ea 株等国内毒株构建的基因缺失疫苗也逐渐被研发出来，并在猪养殖场中广泛使用 (Zhu et al 2011; 陈焕春等 2001)。PRV Ea 株由于具有高致病性和强免疫原性而被广泛研究，如作为表达其他病毒基因的活病毒载体、作为研究其他 PRV 毒株遗传进化关系的参考毒株、作为研究病毒宿主相互作用的模式生物等 (Huang et al 2014; Jiang et al2007; Yao et al 2015; Wang et al 2015)。本实验室在早期研究中鉴定出 PRV Ea LLT基因编码的 11 个 miRNA，靶基因预测结果表明 PRV Ea 编码的 miRNA 与多个病毒自身基因和宿主基因的表达有关 (Wu et al 2012)。由于 PRV Ea 株在基础研究和应用研究中都有重要作用，一般将 PRV Ea 株作为我国重要的 PRV 参考毒株(Szpara et al 2011; Sun et al 2016)。
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2.2 试验材料
伪狂犬病毒鄂 A 株（PRV-Ea）由本实验室分离并保存；伪狂犬病毒河南新乡株（PRV-HNX）由华中农业大学何启盖老师惠赠；伪狂犬病毒 Bartha 株（PRV-Bartha-K61）由湖北科前生物公司提供。猪肾传代细胞（PK-15）购自中国典型培养物保藏中心（武汉大学）；牛肾传代细胞（Madin-Darby bovine kidney, MDBK）购自中国科学院昆明动物研究所。PRV VP5、VP26、UL21、VP13/14、VP16、IE180 兔多抗由本实验室燕凯、陈毓欣、袁振岳、唐崎制备（合成多肽免疫家兔 4 次）；PRV EP0 兔多抗为华南农业大学据春梅老师惠赠；PRV gB、gE 单克隆抗体由湖北科前生物公司提供。Anti-GAPDH 鼠单抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。货号：CW0100M。二抗：辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗兔 IgG 购自武汉飞羿科技有限公司。货号分别为：ZB-2305、E030120。
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第 3 章 LLT miRNA 簇对 PRV 毒力的影响..............47
3.1 前言 ........47
3.2 试验材料 ...........48
3.3 试验方法 ...........53
3.4 结果与分析 .......65
3.5 讨论 .........72
3.6 小结 ..............74
第 4 章 PRV Ea 株细菌人工染色体克隆及 miRNA7 突变株的构建...........75
4.1 前言 ........75
4.2 试验材料 ...........75
4.3 试验方法 ...........77
4.4 结果与分析 .......83
4.5 讨论 ........89
4.6 小结 ........90
第 5 章 结论............91
第 4 章 PRV Ea 株细菌人工染色体克隆及 miRNA7 突变株的构建
4.1 前言
PRV 是伪狂犬病的病原，能在感染猪中建立潜伏感染，造成猪繁殖、神经和呼吸系统疾病，给养殖业造成巨大经济损失。同时，PRV 作为 α 疱疹病毒亚科成员，也是研究疱疹病毒生物学特性的模式生物 (Enquist 1999)。作为小分子非编码基因，病毒 miRNA 能参与调控病毒多种生物学活动。HSV-1 LAT miR-H2 同义突变能增强病毒神经毒力和再激活能力 (Jiang et al 2015;Jiang et al 2016)。本实验室前期研究已鉴定出 PRV 潜伏转录物 LLT Intron 编码的包含 11 个病毒 miRNA 的 miRNA 簇,靶基因预测结果显示 miRNA 簇可能参与调控多个病毒自身及宿主基因的表达 (Anselmo et al 2011; Wu et al 2012)。通过空斑大小及一步增殖曲线比较发现 PRV LLT miRNA 簇缺失株与野毒株有显著差异，PRV miRNA 簇能调控病毒 IE180 和 EP0 蛋白的表达，并与病毒抗凋亡能力相关。体内实验发现miRNA簇与PRV致病性有关，且能作为病毒毒力因子而发挥作用。虽然对 PRV miRNA 簇功能有了一定了解，但关于单个 miRNA 的具体功能仍不清楚。为进一步深入研究各 miRNA 功能，需要构建针对每个 miRNA 的病毒突变株。考虑到基于同源重组的传统突变株构建方法较为繁琐费时，本研究希望通过构建 PRV Ea 株细菌人工染色体克隆而提高各 miRNA 突变株的构建效率，为深入研究 miRNA 及其他 PRV 基因功能打好基础。
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结论
（1）通过三代测序技术 PacBio 结合二代测序技术 Illumina 的方法获得 PRVEa 株全基因组序列，填补了国内经典毒株 Ea 遗传信息的空白。
（2）包括 Ea 株在内的我国 PRV 毒株的进化过程是独立的，不依赖国外毒株，新发现的变异株起源于国内早期经典毒株。PRV 参考株与变异株、弱毒疫苗株间不同的的生物学特性可能与不同时期病毒蛋白的表达水平差异有关。
（3）PRV LLT miRNA 簇与病毒致病性相关，可作为病毒的毒力因子而发挥作用。
（4）构建了 PRV Ea 株细菌人工染色体克隆，使得构建 PRV 突变株更为方便快捷，为后续深入研究 PRV 各 miRNA 和其他基因功能创造了条件。
（5）构建了 PRV miRNA7 缺失突变株 rPRV-ΔmiR7 和回复突变株rPRV-ΔmiR7-R，证明了 PRV miRNA7 与病毒增殖能力有关。
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参考文献（略）