第 1 章 文献综述
1.1 抗病毒天然免疫概述
1.1.1 抗病毒天然免疫简介
为了应对外界环境的各种病原入侵，多细胞动物机体都进化出能对抗病原微生物入侵的免疫系统。免疫系统能够对微生物入侵进行识别、监视、防御和调控，最后清除非正常细胞，以防止微生物损伤机体器官或组织。免疫系统分为天然免疫（innate immunity）和特异性免疫（specific immunity）（Ward et al., 2014）。天然免疫应答是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防线，又称为固有免疫，是机体固有的防御免疫屏障。当病原微生物在感染宿主时产生的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns, PAMPs）被细胞表面或胞内的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别（Gunther et al., 2016）。受体被激活后启动下游信号级联传递，激活转录调控因子调节 I 型干扰素（type I interferon, IFN-I）和促炎细胞因子（pro-inflammatory factors）如 IL-1β、TNF-α等表达。如此，天然免疫在感染及其邻近的细胞建立起抗感染免疫系统，并警鸣免疫细胞危险信号的到来（Sirisinha, 2014）。而 I 型干扰素是感染早期能够产生的细胞因子，它具有抗病毒增殖、抗细胞增生和免疫调节功能。I 型干扰素表达并通过自分泌和旁分泌的形式与细胞膜上的 I 型干扰素受体结合，通过酪氨酸激酶（Janus tyrosine kinase, JAK）和转录传导激活因子（transducer and activator of transcription, STAT）通路激活干扰素刺激基因（interferon stimulated genes, ISGs）表达，合成大量具有抗病毒效应的干扰素诱导蛋白，通过抑制病原微生物基因组复制或者干扰其蛋白合成等方式抑制病原微生物的增殖。同时也帮助塑造适应性免疫反应（Bazan, 1990; Liongue et al., 2013）。如果没有干扰素防御系统，病毒更易感细胞，并且致病性更强（Stark, 2007）。
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1.2 病毒蛋白拮抗干扰素应答的机制
在感染早期，真核生物依赖天然免疫系统来抵抗病毒和其他病原微生物入侵。从 PRRs 识别 PAMPs 开始，到最后 IFN-I 产生整个过程中，每个信号分子都发挥着重要作用。研究已经证实了不同病毒都进化出多种策略破坏 IFN-I 产生过程中的信号传递来逃避细胞的抗病毒防御，其策略包括阻止病原分子被识别、操作信号通路中的关键分子、调控 IFN-I 基因转录翻译等。
1.2.1 病毒蛋白拮抗 I 型干扰素表达
对于 RNA 病毒感染诱发的 RLR 信号通路，这些抵抗 IFN-I 表达的机制包括改变病毒基因组和复制转录中间物来逃避RLR 的识别和调节RIG-I及下游信号分子的活性。因为 5′ppp RNA 结构是 RIG-I 识别的重要特征，修饰这种结构是病毒长期依赖逃避 RIG-I 识别的重要机制之一。比如克里米亚-刚果出血热病毒、博尔纳病病毒(Borna disease virus, BDV)和 汉坦病毒(hantavirus, HTNV)在转录后的基因组中转移5′ppp 基团，使 RIG-I 不能识别病毒 RNA（Habjan et al., 2008）。HTNV 是利用“启动和重排”策略来形成 5′端单磷酸化 RNA（Garcin et al., 1995）。另一方面，BDV 则通过剪切基因组形成3′悬挂结构并转换 5′ppp 至 5′p 修饰来逃避识别（Schneider et al.,2005）。病毒的 5′终端 RNA 也可以通过加冒途径修饰。例如脊髓灰质炎病毒的基因组可以连接到 Vpg 进行加帽修饰，并防止它暴露给 RIG-I 分子（Lee et al., 1977）。病毒的 5′端 RNA 也可以在 2′-O 位置通过 7-甲基鸟嘌呤和甲基化修饰，模仿成宿主mRNA 逃避 RIG-I 识别（Decroly et al., 2011; Devarkar et al., 2016）。
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1.3 冠状病毒的研究进展
冠状病毒（coronaviruses, CoVs）是一类严重危害人类和动物的重要病原。最近几十年，新变异的冠状病毒频频爆发对人和动物造成重大安全威胁，主要包括对人产生高致病性和高死亡率的呼吸道冠状病毒（Severe acute respiratory syndromecoronavirus, SARS-CoV）和中东呼吸道冠状病毒（Middle East respiratory syndrome,MERS-CoV）、对仔猪导致腹泻和高死亡率的肠道冠状病毒猪流行性腹泻病毒（ porcine epidemic diarrhea virus, PEDV ）、 传 染 性 胃 肠 炎 病 毒 （ transmissiblegastroenteritis virus, TGEV）和猪δ冠状病毒（porcine deltacoronavirus, PDCoV），这给公共生物安全和经济都带来重大损失（Zhong et al., 2003; Zaki et al., 2012; Li et al.,2012; Zhao et al., 2013; Zhao et al., 2013; Dong et al., 2016）。因为各病毒粒子入侵宿主结合不同的受体蛋白，所以导致不同冠状病毒感染不同的宿主和不同组织器官（Reguera et al., 2014）。但各冠状病毒之间基因组相对保守，而且其编码的蛋白在病毒复制和组装上的功能也相对保守。
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第 2 章 研究目的与意义
天然免疫系统能够对机体入侵的病原进行最初的探测并诱导初步的抗病毒应答。此外，天然免疫系统对诱导后续的适应性免疫也是必不可少的。而 I 型干扰素包括IFN-β单体和 IFN-α突变体，它们成为天然免疫应答中发挥作用的重要组成部分。病原相关分子模式被模式识别受体识别后，能够诱导 I 型干扰素表达，后续诱导抗病毒效应。但病毒为了能够成功在宿主体内增殖复制，会利用自身的优势采用多种策略抑制 I 型干扰素的产生，从而突破机体的抗病毒免疫防御系统。冠状病毒是一类能够在人和多种动物间跨种传播的烈性传染病。它是单股正链RNA 病毒，复制过程中产生的 5，三磷酸化修饰单链 RNA 和特定的双链 RNA 结构能被 RIG-I 和 MDA5 识别，并诱导下游抗病毒免疫应答。最新爆发的冠状病毒如SARS-CoV、MERS-CoV、PEDV 和 PDCoV 等病原都能够在体内迅速增殖呈现高致病性特征。而适应性和病毒宿主天然免疫相互作用对冠状病毒致病性具有重要作用，所以探究新爆发的 PEDV 和 PDCoV 等冠状病毒拮抗宿天面免疫至关重要。即使爆发较早的 SARS-CoV 和 MHV 其拮抗宿主天然免疫机制也并不完全清楚。冠状病毒 N 蛋白为核衣壳蛋白，功能比较保守，主要是结合病毒基因组，与其他蛋白一起调控病毒基因组转录和复制。在病毒感染早期，N 蛋白便能高丰度地表达，而天然免疫也是发生在病毒感染早期，这为 N 蛋白调控天然免疫提供契机。之前有报道 SARS-CoV 和 MHV N 蛋白分别能抑制 IFN-I 产生或应答，但具体机制不明。本研究分别深入探讨了 PEDV、MHV、SARS-CoV、PDCoV 编码的 N 蛋白抑制IFN-β产生的具体机制。全面解析并对比了α-、β-、δ-冠状病毒的 N 蛋白采用不同的机制来拮抗 I 型干扰素产生。进一步完善了冠状病毒拮抗天然免疫机制，也进一步为全面了解冠状病毒致病性奠定理论基础。
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第 3 章 材料与方法........23
3.1 实验材料.... 23
3.2 实验方法.... 27
第 4 章 结果与分析........34
4.1 PEDV N 蛋白拮抗 IFN-β产生....... 34
4.1.1 PEDV N 蛋白抑制 SEV 诱导的 IFN-β表达...........34
4.1.2 PEDV N 蛋白抑制 IRF3 的活性........... 36
4.1.3 TBK1 可能是 PEDV N 蛋白潜在的靶标.......36
4.1.4 PEDV N 蛋白能与 TBK1 发生相互作用.......37
4.1.5 PEDV N 蛋白阻碍了 IRF3 与 TBK1 之间的相互作用........... 38
4.2 MHV 和 SARS-CoV N 蛋白拮抗 IFN-β产生...........39
4.3 PDCoV N 蛋白抑制 IFN-β产生的分子机制............48
第 5 章 讨论与结论........58
5.1 讨论............ 58
5.2 结论............ 64
第 5 章 讨论与结论
5.1 讨论
干扰素系统是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线。因此，病毒在侵入过程中会利用自身表达的蛋白并运用各种策略靶向天然免疫信号分子，使宿主免疫系统受到抑制进而为病毒入侵机体后增殖提供良好机会。冠状病毒是一类单股正链 RNA 病毒，其复制过程中产生的 dsRNA 中间复合物能被模式识别受体 RIG-I 和 MDA5 识别，但 PEDV、MHV、SARS-CoV、PDCoV 感染却不能诱导干扰素产生。这是因为这些冠状病毒编码的部分蛋白能够抑制 IFN-β产生，使 IFN 抗病毒免疫应答失败。2010 年秋季，中国爆发了新变异的 PEDV 毒株，导致猪场大量仔猪死亡。后续几年持续爆发，并蔓延全球。PEDV 感染并不诱导 IFN-β产生，而关于 PEDV 编码的蛋白对天然免疫的影响研究甚少。本实验以 AJ1102 毒株为对象，探究其编码的蛋白如何抑制 IFN-β产生。我们成功筛选并鉴定了 PEDV N 蛋白能够抑制 IFN-β产生，并解析了具体机制。而冠状病毒 N 蛋白是一类表达早、丰度高、功能保守且多样的核衣壳蛋白。本实验继续揭示其他冠状病毒如 MHV、SARS-CoV、PDCoV 编码的 N蛋白抑制 IFN 产生的分子机制，从而系统性地了解到冠状病毒 N 蛋白调控 IFN-β机制。
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结论
5.2.1 详细阐明了 PEDV N 蛋白抑制 IFN-β产生的分子机制。发现 PEDV N 蛋白能够与 TBK1 发生相互作用，减弱 TBK1 招募 IRF3，从而使 TBK1 磷酸化修饰IRF3 水平下降，最终导致 IFN-β表达减少。
5.2.2 发现 MHV 和 SARS-CoV N 蛋白采用同一种策略抑制 IFN-β产生，它们靶向RIG-I 上游信号分子，即通过与 RIG-I 激活因子 PACT 相互作用，使 PACT 结合 RIG-I/MDA5 能力下降，从而降低了 PACT 协助 RIG-I/MDA5 激活的 IFN-β活性。此外，MHV 和 SARS-CoV N 与 PACT 的相互作用是依赖 RNA 的。
5.2.3 发现 PDCoV N 蛋白能够显著性的抑制 IFN-β产生，其机制是通过结合 RIG-I的 Hel 和 CTD 结构域，抑制 RIG-I 识别或结合其激活分子 dsRNA 和 PACT。但 PDCoV N 蛋白与 RIG-I 的相互作用是不依赖 RNA 的。此外，PDCoV N 蛋白还能与 PACT 和 RNA 结合。
5.2.4 挖掘出PDCoVN蛋白NTD结构域和CTD结构域的部分功能。我们发现NTD结构能抑制 IFN-β产生、与 RIG-I 发生相互作用、负责胞浆定位、能结合 RNA，但与 RNA 结合能力较弱；CTD 拥有核定位信号序列和结合 RNA 结合能力，且其与 RNA 结合能力强。
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参考文献（略）