前 言
头颈部癌症是指位于鼻腔，鼻旁窦，口腔，唾液腺，咽和喉区域的恶性肿瘤，从组织学类型上分类以鳞状细胞癌居多。口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cellcarcinoma，OSCC）是全球过去几十年来研究最多，研究水平也较为深入的恶性肿瘤之一，其发病率占所有恶性肿瘤的 16%-40%[1]。OSCC 的发生和发展受到诸多方面因素的影响，其主要分为两大类：一是特定的遗传学特征性；二是环境因素包括来自烟草，槟榔，酒精饮料，以及慢性炎症和病毒感染等因素导致基因突变[2]。我国口腔鳞状细胞癌以舌鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）最为常见。由于舌体的解剖生理位置，增加了其频繁接触各种机械刺激的可能性，在 OSCC 中的发病率最高，约占口腔癌发病率的 1/3-1/2[3]。目前 SCC 的治疗手段仍然以手术切除为主配合放疗，化疗等一些列的综合治疗方法。尽管在临床诊断和治疗方面上已经取得了一定的突破，但在过去的 50 年中，口腔鳞癌患者的 5年生存率[4]并没有得到显著的改善[5]。当今口腔鳞状细胞癌仍然是一个待治疗的严重影响健康的问题[6~7]。口腔鳞状细胞癌是一种比较复杂的分子水平疾病，其与多个途径都相关。因此了解 OSCC 细胞增殖和凋亡的机制是目前我们应该重视的问题。
ST1926(E-3-(4'-羟基-3'-金刚烷基联苯-4-基)丙烯酸)，它属于一类具有金刚烷基的类视黄醇化合物。与 CD473(6-[3-(1-Adamantyl)-4-hydroxyphenyl]-2-naphthalene carboxy lic acid，AHPN )相比较，ST1926 具有更强的促细胞凋亡活性[8]。对多种肿瘤细胞具有有效的抗肿瘤细胞增殖活性[9~10]。且对多种肿瘤细胞发挥促凋亡活性和抗肿瘤活性时对宿主的副作用是允许范围的最小[10~14]。根据报道，金刚烷基类视黄醇 ST1926 同时也是一种有效的卵巢癌细胞凋亡诱导剂[15]。Garattini E 等人则口服给药 ST1926[16~17]进行不同种类的白血病和异种移植的实体肿瘤的 I 期临床实验。最近的研究表明组成型激活的信号转导和转录激活因子 3（STAT3）参与了许多恶性肿瘤细胞的凋亡过程[18~21]。有报道显示 p-STAT3 在OSCC 肿瘤细胞中高表达[18,20]多种 JAK 和 STAT3 抑制剂可以抑制 OSCC 的生长[19,22,23,24,25]。目前 ST1926 对舌鳞状细胞癌的作用研究报道较少，对细胞增殖凋亡的影响机制尚不明确。本实验的目的是探究 ST1926 对舌鳞状细胞癌细胞株 Tscca 细胞增殖和细胞凋亡的影响，探讨其可能存在的凋亡机制。使用 MTT 比色法，流式细胞仪以及蛋白免疫印迹等实验方法检验细胞增殖抑制率，细胞早期凋亡率和凋亡因子 caspase3,caspase7 的蛋白表达水平，以及与肿瘤细胞异常增生密切相关的p-STAT3 的蛋白表达水平，探究其可能存在的凋亡机制。
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实验材料与方法
一、实验材料
(一)主要仪器
仪器名称 公司 国别恒温恒湿培养箱 Thermo 美国显微镜 Leica 德国普通台式离心机 Thermo 美国酶标仪 Thermo 美国全自动洗板机 Thermo 美国流式细胞仪 BD 美国水浴锅 精宏 中国普通冰箱 海尔 中国-80 度冰箱 Thermo 美国高压灭菌锅 Zealway 中国.
二、实验方法
(一)Tscca细胞培养人舌癌细胞株
Tscca 细胞由上海拜力生物公司购得，细胞培养选择含有 10%胎牛血清（FBS）和 1%双抗（青霉素 100U/mL、链霉素 100mg/L）的 RPMI1640培养基在 5%CO2，37℃恒温恒湿细胞培养箱中培养，每日观察细胞生长状态，每2~3 天传代一次。待细胞生长到对数生长期时，收集细胞，进行以下实验。(二)MTT 比色法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测不同浓度 ST1926 对舌癌细胞系 Tscca 细胞生长情况的影响(1)舌癌细胞 Tscca 铺满细胞培养瓶 60%~80%时，加入 1mLEDTA-胰酶后放入培养箱消化细胞，在显微镜下观察细胞脱壁情况，适时加入 5mL 完全 RPIM1640培养基终止反应，收集细胞放入离心机 1000rpm 离心 6 分钟。重悬细胞，在显微镜下细胞计数。(2)将混匀的细胞悬液铺 96 孔板，每孔 200μL 体系，每孔细胞数 5000 个，放入 5%CO2的 37℃培养箱培养 24 小时。(3)待细胞贴壁后，使用无胎牛血清培养基配置浓度为 1、2、3、5、7、15μmol/L 的 ST1926 备用，将实验分为 7 组，每组设置 5 个副孔，每孔体系 200μL，分别 给 予 以 下 处 理 ： 0μmol/LST1926 ， 1μmol/LST1926 ， 2μmol/LST1926 ，3μmol/LST1926，5μmol/LST1926,7μmol/LST1926,15μmol/LST1926。(4)放入培养箱继续培养 24、48 和 72 小时，取出 96 孔板，避光条件下每孔加入 15μLMTT(5mg/mL)溶液，放入 5%CO2的 37℃细胞培养箱孵育 4 个小时。
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三、论文前言............6
实验材料与方法..........7
实验结果....13
讨论............21
结论............24
四、本研究创新性的自我评价............25
五、参考文献....26
讨 论
口腔癌是世界上第六大最常见的实体癌，据统计每年全世界有约 30 万新增病例和 130,000 例的死亡病例。超过 90％的头颈部癌症的发病部位在口腔，且在所有的恶性上皮肿瘤中有超过 90％是发生在口腔鳞状细胞癌[26~27]。舌鳞状细胞癌（TSCC，tongue squamous cell carcinoma）是最常见的口腔鳞状细胞癌[28~31]。舌鳞状细胞癌往往会导致患者咀嚼，言语和吞咽等功能的障碍。TSCC 的患者在治疗后最常见的不良预后因素是淋巴结的远处转移[32~35]，导致患者预后不良。因此，了解舌癌发生发展的分子机制用以加强治疗的疗效是至关重要的。ST1926 是一种非典型的类视黄醇衍生物。其凋亡活性的作用机制并不是通过转录类视黄醇相关的靶基因来激活类视黄醇受体（RARs）[36~41]。Maddalena 等人的研究显示 ST1926 和 CD437 都诱导了 DNA 双链的断裂[42]。由于其独特的抗肿瘤作用机制使它受到越来越多的关注，在白血病和一些实体瘤细胞[43~44]研究中显示，它可以有效的作用于细胞内部，诱导细胞早期 DNA 损伤，细胞循环停滞最终诱导细胞凋亡。其作用机制与其他早期研发的类视黄醇化合物相比有所不同，即不依赖激活视黄酸受体的信号通路作用，发挥生长抑制和促凋亡活性的作用[45~47]。本实验在体外培养 Tscca 细胞至对数生长期后，分别给予 0、1、2、3、5、7、15μmol/L 的 ST1926 作用，在电子显微镜下发现，随着给药浓度的增加，细胞的生长状态受到影响，细胞出现细胞膜皱缩，通透性改变。增加培养时间，MTT 比色法显示，相同的 ST1926 浓度条件下，随着培养时间的增加，细胞增殖抑制率明显增加，当作用时间相同时，伴随着给药浓度的加大，细胞增殖抑制率也明显增加。这提示了 ST1926 对人舌鳞癌细胞株 Tscca 细胞的增殖有抑制作用。证实ST1926 对多种癌细胞有促凋亡作用，其中包括人舌鳞癌细胞。为了进一步验证ST1926 对细胞凋亡的影响，我们利用 AnnexinV 蛋白可与早期凋亡的细胞的胞膜结合，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）透过细胞膜将细胞核染红，将处于不同凋亡时期的细胞区分开的特点，使用流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测ST1926对舌鳞癌细胞株 Tscca 细胞凋亡的作用。结果显示作用细胞 72 小时后，各实验组细胞早期凋亡率分别为 3.63%，32.4%，46.4%和 55.8%。分析结果我们发现，细胞早期凋亡率随作用浓度的增加呈上升趋势。提示 ST1926 不仅抑制 Tscca 细胞增殖，同时还诱导细胞凋亡。为揭示其潜在的促凋亡作用机制，我们使用蛋白免疫印迹法检测了几种与凋亡相关的因子的蛋白质表达水平的变化。caspase3 和caspase7 是被启动子胱天蛋白酶（caspase8 和 caspase9）活化的效应半胱天冬酶，通过切割细胞底物在下游执行一系列的促凋亡作用[48]。我们已明确，细胞色素 C，caspase3 和 Bcl-2 基因均为凋亡途径中经典的调节剂[49~52]。
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结 论
1.新型类视黄醇 ST1926 可以抑制人舌鳞癌细胞株 Tscca 的增殖。2.上调 cleaved-caspase3，caspase7 蛋白表达水平，诱导细胞凋亡。3.下调 p-STAT3 蛋白表达水平，其作用机制可能与抑制 STAT3 蛋白活化有关。
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参考文献（略）