第 1 章 引 言
子宫内膜癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤，起源于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，占女性全身恶性肿瘤 7%[1]。子宫内膜样腺癌约占子宫内膜癌的 80%[2]。近年来，由于饮食习惯的改变、外源性雌激素的不适当应用，发病率呈逐年上升趋势且呈年轻化，严重影响了女性的健康。子宫内膜癌是一种涉及多因素、多步骤的疾病，它的发生与发展是一个漫长的过程[3]。子宫内膜癌的病因不十分清楚。随着科技的迅猛发展、分子生物学亦迅速发展，肿瘤的恶性程度及临床预后的判断越来越依赖于多基因表达及相关性分析，这使得影响细胞增殖、分化以及癌变的相关基因越来越受到关注，而对于它们在肿瘤发生、发展中的作用也越发受到重视，因此，肿瘤的发生和发展在分子水平上的研究已经成为了研究热点[4]。肥胖、高血压、糖尿病是子宫内膜癌发生的常见高危因素。流行病学研究发现子宫内膜癌的一些保护因素，如运动、低饱和脂肪酸饮食、多食用水果及蔬菜、母乳喂养及服用避孕药[5]。随着社会文明及经济发展，群众健康意识的增强及医疗水平的提高，使得更多子宫内膜癌患者被检出并及时治疗。约 90%的子宫内膜癌患者出现阴道流血或阴道排液症状[6]，主要表现为绝经后阴道流血，量少。但是随着发病年轻化，越来越多尚未绝经女性因表现为月经紊乱、月经增多、经期延长被发现患有子宫内膜癌。阴道排液多为血性分泌物，如果合并感染，可出现脓血性排液，可伴恶臭。若癌肿累及宫颈内口引起宫腔积液，则可出现下腹疼痛。晚期患者由于癌组织浸润周围组织或者压迫周围神经，可引起下腹部或腰骶部疼痛。子宫内膜癌诊断方法一般是结合患者的病史、临床症状及相关检查如血清 CA125、B 型超声、分段诊刮取病理、宫腔镜检查、CT、MRI 等方法来协助诊断及评估患者病情。通过分段诊刮刮取宫腔组织送病理检查，并根据相关病理结果进行手术取得术后病理，最终得以确诊。子宫内膜癌的转移途径包括直接蔓延、淋巴转移、血行转移[7]。在治疗上，主要根据患者年龄、生育需求、临床分期、身体素质、医疗设备水平等客观条件等制定个体化治疗方案，临床上常采用以手术治疗、放射治疗为主，化学治疗为辅的综合治疗方案[8]。
目前对于早期的内膜癌治愈率较高，然而伴发局部复发或远处转移的患者预后较差。由于取材的局限或误诊为月经不调，子宫内膜癌的早期诊断率低于宫颈癌，因此探索研究新的检测指标在子宫内膜癌的发生、发展、浸润及转移中的作用机理，将对子宫内膜癌的临床诊断、预后评价产生极大的指导意义。肿瘤标志物是恶性肿瘤发生发展过程中，由恶性肿瘤细胞的基因过度表达或者由机体对肿瘤细胞异常反应而产生的，以反应肿瘤发生和生长的物质，可于患者血液、体液、细胞或者组织中检测到，方法包括免疫学法、生物化学法等。近年来，现在临床上应用最广的肿瘤标记物是 CA125[10]。现 DKK1 和骨桥蛋白正在被越来越多的研究者发现[9]，它们可能成为子宫内膜癌新生标志物的蛋白。目前 DKK1 和骨桥蛋白与子宫内膜样腺癌的关系的研究甚少。本文通过检测子宫内膜样腺癌患者血清 DKK1、骨桥蛋白的表达水平，探讨其临床应用价值。Wnt 信号通路的异常激活在肿瘤的发病和进展过程中发挥重要作用。有研究证实[11]Wnt 信号通路的异常激活在子宫内膜样腺癌发生中发挥促进作用。DKKl是经典 Wnt 信号通路的胞外抑制剂，最早是在研究非洲爪蟾胚胎细胞的早期发育过程中被发现的[12]，DKKl 通过抑制 Wnt 信号通路而参与头部的形成，DKK1基因定位于人类 l0 号染色体上，其编码的分泌性糖蛋白由含有 266 个氨基酸组成，相对分子量为 35×103，包括 31 个氨基酸组成的 N 端信号肽段、2 个半胱氨酸富集区以及具有糖基化作用的 C 端[13]。DKKl 通过与 Wnt 蛋白竞争结合低密度脂蛋白受体相关蛋白直接拮抗 Wnt 蛋白活性，或通过 Kremen 受体间接与低密度脂蛋白受体相关蛋白相结合从而抑制 Wnt 信号通路。DKKl 在肿瘤中的作用目前尚未达成共识。临床研究显示[14]，DKKl 在胃肠道肿瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤以及结肠癌中表达减少或沉默，提示 DKKl 在上述肿瘤中发挥抑癌基因的作用。然而，在多发性骨髓瘤、肝癌和卵巢浆液性恶性肿瘤中 DKKl 表达增多，提示 DKKl 在这些肿瘤发生中具有促进作用。提示其可作为恶性肿瘤诊断的一种新标志物。在国内外文献中发现[15]，血清 DKK1 与生殖系统恶性肿瘤如卵巢癌、子宫内膜样腺癌和宫颈癌的发生发展关系密切，对其诊断及预后有一定价值，可能成为妇科恶性肿瘤的一个监测指标应用于临床。
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第 2 章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 研究对象
收集吉林大学中日联谊医院和吉林省人民医院 2014 年 12 月-2016 年 11月间结合临床和组织病理，明确诊断为子宫内膜样腺癌 46 例，年龄 25-69 岁之间，计算平均年龄 53.5±9.9 岁；不典型性增生子宫内膜 30 例，平均年龄 50.5±9.3 岁；增生子宫内膜 48 例（20 例单纯性增生，28 例复杂性增生），平均年龄 51.2±9.3 岁；正常子宫内膜 30 例，平均年龄 51.3±9.5 岁。严格按照国际妇产科联盟( FIGO)标准进行手术-病理分期和组织病理学分级：子宫内膜癌 I～II期共 33 例；III～Ⅳ期共 13 例。46 例子宫内膜样腺癌患者中共 38 例患者行盆腔淋巴结清扫，其中 28 例患者无淋巴结转移，10 例有淋巴结转移。根据子宫内膜腺癌组织病理分期：高分化子宫内膜腺癌（G1）和中分化子宫内膜腺癌（G2）共 24 例，低分化子宫内膜腺癌（G3） 22 例。所有纳入本实验研究的患者术前均未接受任何放疗、化疗及性激素药物等治疗，并排除患有其他系统恶性肿瘤。入选子宫内膜样腺癌研究组患者，均为经手术病理确诊；入选不典型性增生子宫内膜、子宫内膜增生组及正常子宫内膜组患者，均为诊断性刮宫术取子宫内膜送病理检查确诊。
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2.2 实验方法及步骤
所有实验对象均于清晨采集空腹肘静脉血 5 毫升，血液标本加入非抗凝管中。于室温下凝固 50 分钟。在 4℃环境下，以 2000 r/分速度离心 10 分钟，吸取血清，弃去不溶物。将血清分别移置 EP 管内，做好各自标记，置于-80℃冰箱内储藏，所有血清标本避免反复冻融、溶血[18]。测定血清 DKK1 水平（北京中杉生物科技有限公司），骨桥蛋白水平（试剂盒为美国 Quidel 公司产品），严格按照说明书操作。
2.2.2 ELISA 测定血清 DKK1、骨桥蛋白的含量
1. 稀释：在酶标包被板上设标准品孔 10 个，采用倍比稀释。在第 1、2 孔中分别加标准品 100μL 和标准品稀释液 50μL，混匀；然后从第 1、2 孔中各取100μL 分别加到第 3、4 孔，再在第 3、4 孔分别加标准品稀释液 50μL，混匀；在第 3、4 孔中先各取 50μL 弃掉，再各取 50μL 分别加入第 5、6 孔中，以此类推。最后从第 9、10 孔中各取 50μL 弃掉。2. 加样：设空白孔(不加酶标试剂和样品)和待测样品孔。待测样品孔中先加样品稀释液 40μL，再加待测样品 10μL。注意加样时将样品加于酶标板孔底部，避免触及孔壁，混匀。3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释备用。
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第 3 章 结 果7
3.1 不同子宫内膜患者血清DKK1、骨桥蛋白的浓度均数和阳性率7
3.2 子宫内膜样腺癌手术前后血清DKK1和骨桥蛋白浓度均数比较8
3.3 血清 DKK1、骨桥蛋白浓度均数与子宫内膜样腺癌临床特征的关系9
3.4 血清 DKK1 和骨桥蛋白在子宫内膜样腺癌中表达的相关性11
第 4 章 讨 论12
4.1 DKK1 在子宫内膜样腺癌中的表达及意义12
4.2 骨桥蛋白在子宫内膜样腺癌中的表达及意义13
4.3 DKK1和骨桥蛋白在子宫内膜样腺癌血清中表达相关性及临床意义15
第 4 章 讨 论
子宫内膜样腺癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，死亡率较高，对其早期诊断及有效治疗并判定预后，成为近年来研究的热点问题[19]。肿瘤的生长、侵袭及转移是一个复杂的多步骤过程。DKK1 是近年新发现的一种分泌型蛋白，可通过非经典的 Wnt 信号转导通路发挥促癌基因作用。在诱导肿瘤细胞凋亡、调控肿瘤细胞的骨转移方面以及某些肿瘤细胞浸润和侵袭方面发挥重要作用[20]。骨桥蛋白是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，广泛分布在各种组织及体液中，可促进肿瘤细胞生长和介导肿瘤细胞的侵袭[21]。骨桥蛋白通过第二信使 Ca2+，介导细胞-细胞、细胞-基质的相互作用，使细胞分泌金属蛋白酶等从而促进细胞的迁移。骨桥蛋白还在内皮细胞中通过 NF-KB 途径来控制细胞的凋亡[22]。并且还能分泌白细胞介素，参与免疫反应和体内的炎症反应，在肿瘤的发生、发展中，新生血管的形成起到很重要的作用，它是肿瘤细胞进行新陈代谢时所需要的营养物质和产生的代谢废物运输的通道。骨桥蛋白通过与血管内皮细胞结合参与肿瘤的血管生成，促进肿瘤的生长。近年来还有许多研究表明[23]，骨桥蛋白通过调控多个细胞因子、受体及粘附分子，从而参与肿瘤细胞的浸润和转移。本实验研究旨在探讨血清 DKK1 和骨桥蛋白在子宫内膜样腺癌中的表达情况，为子宫内膜样腺癌的诊断及预后评估提供一定的理论依据。
4.1 DKK1 在子宫内膜样腺癌中的表达及意义
DKK1 是分泌蛋白的一种，为肿瘤发展经典 Wnt 信号通路的负性调节蛋白，在细胞发展的各个环节，包括细胞增殖，分化，存活，细胞凋亡和细胞恶变上均起着举足轻重的作用[24]。Wnt 信号通路在胚胎生长、发育、调节平衡过程中扮演着重要的角色，也与癌变有着及其密切的联系，Wnt 通路介导了多种细胞发展过程包括生长，增殖，分化，裂解，凋亡，死亡[25]。Wnt 信号通路牵连的调控失调可导致恶性肿瘤的发生及加速癌症的发展，包括肝癌、肺癌、乳腺、结肠癌、白血病、骨髓瘤、前列腺癌等[26]。 DKK1 作为 Wnt 信号通路的抑制剂，主要是与细胞表面受体 LRP5/LRP6 结合而发挥其功效，另有研究认为 DKK1 还可以与跨膜受体 Krm1 和 Krm2 相结合，并且与 Krm1 和 Krm2 的结合具有高度亲和力，从而抑制 Wnt/β-catenin 信号通路。还有研究指出 DKK1 蛋白在不结合Krm 和 Krm2 受体时也同样可以抑制 Wnt/β-catenin 信号通路， DKK1 发挥效应并不是完全依赖Krms，目前仍还需大量研究来了解DKK1与 Wnt/β-catenin 信号通路之间的相互联系和作用机制[27]。研究发现 DKK1 在不同肿瘤中的浓度含量和作用是不相同的。大量研究表明[28]，DKK1 参与了多种类型的癌细胞的恶化过程，它在肝癌、肝母细胞瘤、食道癌、肺癌、乳腺癌、及骨髓瘤等肿瘤中呈高表达[29]。目前对于 DKK1 是如何激活或抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的复杂作用机制尚未可知，有待进一步研究。DKK1 在多种肿瘤中的显著表达差异及其分泌蛋白的特性使其有可能成为一个新的血清诊断学指标用于肿瘤的诊断、复发检测和预后分析。
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结 论
1. 血清 DKK1 和骨桥蛋白在子宫内膜样腺癌的高表达，可能参与了恶性肿瘤的发生、发展。2. 血清 DKK1 与骨桥蛋白可能参与了子宫内膜样腺癌的转移与浸润过程。3. 血清 DKK1、骨桥蛋白对子宫内膜样腺癌术后病情评估有一定的参考价值。4. 血清 DKK1、骨桥蛋白二者联合检测可能对子宫内膜样腺癌的诊断有一定的价值。
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参考文献（略）