第一部分
前言
间充质干细胞(mesenchymal stem cells )是最早从骨髓中分离出的非造血类间质细胞。随后在成体其它结缔组织中也发现了间充质肝细胞。可以增殖、分化为多种结缔组织细胞，如神经细胞[6]、骨细胞软骨细胞、月旨肪细胞肌细胞和骨髓基质细胞等[24_26]。间充质干细胞在组织发生损伤、炎症或坏死时，通过分子信号，诱导间充质干细胞活化修复组织[27]。静脉注射MSC会发现MSC迁移到损伤部位在心肌梗死骨折大脑缺血[31_32]、脊椎损伤[33]等情况下，这一修复功能均得到了证明[29]。有研究发现，将MSCs皮下注射到损伤的膝关节附近，可以使损伤的软骨和半月板再生[34]。
分离MSC的方法主要有三种：(1)全骨髓贴壁培养法，由于骨髓腔内还有少量的细胞外基质，抽取的骨髓很容易通过机械方法如吹打等方法破碎基质，将细胞打均匀。细胞接种于培养皿后，BMSC可以快速的點附在培养皿上，通过反复换液将不具备黏附能力的造血干细胞去除。(2)密度梯度离心法，将骨髓样品抗凝处理后，转入装有密度为1.073的密度梯度溶液的离心管中，室温下离心，大部分红细胞沉淀下来，有核细胞在分界面和上层液体中，吸取有核细胞培养。(3)根据MSC表面标志，利用流式细胞仪进行分选。
由于骨髓腔内含有少量的细胞外基质，抽取的骨髓很容易通过机械的方法，利用吹打的方式将造血类细胞和间充质干细胞分离为单细胞状态，当低密度接种后，BMSC可以迅速點附在细胞培养皿上，通过反复换液就可将造血干细胞去除。我们利用Percoll密度梯度离心法首先分离出骨髓中的单个核细胞(mononucleated cells),再将其接种到培养皿上进行贴壁蹄选、扩增。通过加入血管内皮生长因子VEGF诱导MSC向内皮细胞分化，为MSC在血管内皮修复及血管新生中的应用奠定细胞学基础。
材料与方法
1试验用动物
健康C57BL/5J小鼠40只，体重2()±5g，雌雄各半。购买并饲养与复旦大学上海医学院动物实验室，环境为SPF级别，自由摄取词料和水，动物使用符合上海市动物管理委员会条例。
2主要试剂
DMEM低糖培养基 GIBCO公司
DMEM高糖培养基 GIBCO公司
胎牛血清(Febal bovine serum，FBS)GIBCO 公司
M199培养基 GIBCO公司
血管内皮生长因子(VEGF) Peprotech公司
兔抗小鼠VWF单克隆抗体 Abeam公司
兔抗小鼠CD34单克隆抗体 Abeam公司
FITC标记兔抗小鼠CD29单克隆抗体Abeam公司
FITC标记兔抗小鼠CD105单克隆抗体Abeam公司
PE标记兔抗小鼠CD45单克隆抗体Abeam公司
PE标记兔抗小鼠CD90单克隆抗体Abeam公司
PE标记兔抗小鼠KDR单克隆抗体Abeam公司
4’，6-二脒基-2-苯基n引噪（DAPI)Sigma公司
噻哩蓝(MTT) Sigma公司
淋巴细胞分离液(Percoll) Sigma公司
Matrigel基质胶 BD公司
憐酸盐缓冲液(PBS) Gibco公司
二甲基亚柄(DMSO) Sigma公司
Dil标记乙醜低密度脂蛋白(Dil-acLDL)Sigma公司
FITC标记的荆豆凝集素1 (FITC-UEA-1)Sigma公司
胰酶-乙二胺四乙酸 Sigma公司
青霉素-链霉素 Sigma公司
10%山羊血清 Boster公司
二氨基联苯胺(DAB)显色剂Boster公司
地塞米松、n引哚美辛、油红、1-甲基-3-异丁基-黄噪呤、胰岛素、均为国产分析纯
3主要仪器设备
超净工作台 苏州净化设备有限公司
二氧化碳培养箱 Heraeus公司
倒置相差显微镜 OLYMPUS公司
倒置突光显微镜 OLYMPUS公司
正置焚光显微镜 OLYMPUS公司
激光共聚焦显微镜 Leica公司
电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司
高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂
电热恒温水浴箱 上海跃进医疗器械一厂
Midi Plus电动移液器 上海大龙医疗设备有限公司
移液枪酶标仪 BIO-RAD公司
流式细胞仪 BD公司
低温冰箱 (-20°C、-80°C)日本三洋公司
细胞培养皿(直径35mm、60mm和100mm)、离心管(15ml和50ml)、移液管(1ml、10ml、25ml)、细胞冻存管、96、24、6孔细胞培养板Coming公司
4主要溶液的配制
1Ml99培养液
溶液组分 含量
Ml99培养基
胎牛血清 10%
青霉素-链霉素 100单位/ml
血管内皮生长因子 5ng/ml
依次在M199培养基中加入上述成分，每瓶500ml分装，4°C保存备用
2DMEM培养液
溶液组分含量
DMEM低糖培养液
胎牛血清 10%
青霉素-链霉素 100单位/ml
依次在DMEM培养基中加入上述成分，每瓶500ml分装，4°C保存备用
3 月旨肪诱导培养液
溶液组分 含量
DMEM低糖培养液
胎牛血清 10%
双抗 100单位/ml
地塞米松 l[nnol/L
吲哚美辛 lOO^imol/L
胰岛素 lOmg/L
1-甲基-3-异丁基-黄噪呤0.5mmol/L
依次在DMEM培养基中加入上述成分，每瓶500ml分装，4°C保存备用
3MTT 溶液(5mg/ml)：
取MTT lOOmg,溶于20ml的PBS中，0.22pm的一次性滤器过滤除菌，分装后，-20°C避光保存备。
4细胞冻存液
DMSO： FBS：培养液=1: 1： 8，加入DMSO，FBS到培养液，分装，4°C保存备用。
5试验方法
1小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养1.20g健康C57BL/6J小鼠，颈椎脱臼法处死小鼠，完全浸没于75%的乙醇中5min，超净工作台上解剖小鼠的股骨和腔骨，注射器抽取DMEM低糖培养液(含肝素lOu/ml)，冲洗骨髓腔3-4次，冲出骨髓细胞，轻轻吹打，制成单细胞悬液。
2)将上述细胞悬液按1:1的比例，缓缓加入预先置有密度为1.073的Percoll细胞分离液的试管中，室温水平离心2000rpm/min,离心20分钟。
3)离心后，可见管内分为四层，上层为血楽、细胞培养液和血小板，中层为淋巴细胞分离液，下层主要是红细胞和多核白细胞，在上层和中层之间为一层云雾状单个核细胞层。
DMSO： FBS：培养液=1: 1： 8，加入DMSO，FBS到培养液，分装，4°C保存备用。
4)吸取云雾状单个核细胞层，加入DMEM低糖培养基，1500rpm离心3min。
5)洗洛两遍。用DMEM低糖培养基(10%FBS)重悬细胞，混匀后计数，以lxl04/ml接种于细胞培养皿中，置于37°C、5%C02细胞培养箱中培养。
6)接种48h后，PBS轻轻冲洗，洗去未贴壁的细胞，更换新鲜的培养液。
7)以后每三天换液一次，同时倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态。等到一周左右，细胞长到80%融合时，0.25胰酶-EDTA消化，按1: 4的比例进行细胞传代。
2骨髓间充质干细胞流式鉴定
1)取传代扩增后的上述P2代细胞，0.25%胰酶-EDTA消化3分钟，DMEM-LG(10%FBS)终止消化，1500rpm离心3分钟，PBS溶液清洗，1500rmp再次离心三分钟，PBS溶液调整细胞浓度至l><106/ml。将细胞悬液分装至Eppendorf管。
第二部分：可降解Poly(EC-CL)电纺膜............................................征 30-41
前言................................................ 30
材料与...................................................................30-33
结果..................................................... 33-38
讨论 ......................................38-40
结............................................... 40-41
第三部分：Poly(EC-CL)/VEGF电纺支架的制备及.................................. 41-60
前言........................................... 41
材料与................................................................... 41-48
结果........................................................................ 48-57
讨....................................................................... 57-59
结........................................................................... 59-60
第四部分：仿生肝脏血管网络的构................................................... 60-74
结论：
组织工程化组织的构建是以修复组织、器官缺损为最终目的的，组织工程化器官的临床应用将进一步改变现行的医学模式，将再生医学应用于疾病的治疗，为医学的发展带来翻天覆地的变化。
参考文献
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