第一章 绪论
1.1 大麦概况
栽培大麦（Hordeum vulgare subsp. vulgare, Hv）是禾本科大麦属二倍体（2n=14）一年生草本植物，也是继玉米、水稻和小麦之后的第四大禾本科粮食作物（FAO dataset 2019），大约 11,000年前在西亚“新月沃地”被驯化种植（BADR et al., 2000）。大麦具有生育期短、适应性强和分布性广等特点，是禾本科作物中抗逆性较强的作物之一（DAWSON et al., 2015），大麦根据成熟后籽粒与稃壳是否黏连可以分为皮大麦和裸大麦，裸大麦在不同地区称呼不同，在青海、西藏地区称为“青稞”，在长江中下游流域称为“元麦”，在北方地区称为“米麦”；此外，根据棱形，大麦可分为二棱大麦和六棱大麦。当前，全球大麦总产量的 75%用于家畜饲料，20%用于啤酒和威士忌酿造，5%用于制作食品和保健品等（FAO dataset 2019）。随着我国畜牧业的发展、啤酒工业的兴盛和大麦保健品的兴起，我国对于大麦的需求量逐年增加，2015-2020 年均进口量高达 726 万吨，是仅次于大豆的我国第二大进口粮食作物。在大麦的生长发育过程中，病害是引起大麦减产与品质降低的重要因素，其中大麦黄花叶病是危害性最为严重的病害之一。
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1.2 大麦黄花叶病概述
大麦黄花叶病是由大麦黄花叶病毒（Barley yellow mosaic virus, BaYMV）和大麦温和花叶病毒（Barley mild mosaic virus, BaMMV）单一或复合感染引起的土传病毒病害，两种病毒均属于马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）。该病害是东亚和欧洲地区冬大麦产区的主要病害之一（JIANG et al., 2020），感病后一般减产 10%-30%，在极端环境下减产可达70%-80%，甚至绝收（PLUMB et al., 2007）。
1.2.1 大麦黄花叶病的传播与发生
大麦黄花叶病于 20 世纪 40 年代在日本首次被报道（IKATA et al., 1940），在 20 世纪 50 年代中国和韩国相继报道了该病害的发生（周锡康 等, 1985; LEE et al., 2006）。20 世纪 70 年代，由于优质啤酒大麦品种“早熟 3 号”在我国大面积推广，该品种高感大麦黄花叶病，导致该病在我国大面积爆发，造成秋播大麦严重减产甚至绝收。目前，该病害仍然是我国长江中下游流域冬大麦产区的主要威胁（CHEN, 2005）。在欧洲地区，大麦黄花叶病于 1978 年首次在德国被报道（HUTH et al., 1978），随后迅速蔓延到欧洲其它国家（KUHNE, 2009），目前在近二十个欧洲国家均有该病害的发生。以德国为例，1983 年该病害尚零星发生，1994 年该病害已经蔓延到超过 80%的大麦种植区域。在德国、英国、法国、西班牙等大麦主产国，该病害是威胁大麦生产的主要病害（HILL et al., 1989; HUTH et al., 1984）。在土壤中，病原微生物 BaY MV 和 BaMMV 寄生于禾谷多黏菌的休眠孢子中，休眠孢子为病毒颗粒提供保护，使其在环境条件恶劣或者无宿主的条件下存活长达数十年之久，因此，该病害一旦发生即会成为长期持久的病害威胁。
图 1-1 大麦黄花叶病侵染大麦过程
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 大麦种质资源和遗传群体构建
本研究采用的 900 份大麦自然群体材料，来源于中国国家作物种质库和德国联邦作物种质库，结合历史表型数据、考虑地理分布与表型变异等，从 4 万多份大麦种质资源材料中挑选出来，并于 2018 年-2020 年播种在江苏流行病区盐城、扬州等两个试验点，进行大麦黄花叶病自然接种和田间病情指数调查。
根据中国国家作物种质库的历史表型数据和江苏流行病区田间抗病性调查的结果，挑选完全抗病的中国地方品种“尺八大麦”和高感日本栽培大麦品种“关东二条 18 号”为亲本材料，通过杂交构建 F1 种子，自交获得了双亲遗传群体，包含 102 个单株的 F2 群体，对 F2:3 代植株行收，挑选一个杂合的 F4 代家系；通过分子标记辅助选择，完成了 456 个单株的基因型鉴定，保留其中的 91 株，用于后续高世代群体的发展与抗病性遗传效应的验证。
2.1.2 主要试剂及仪器
本实验所用主要试剂：RNAzol Reagen（t总 RNA 提取试剂，北京金百特生物技术有限公司，货号 R011-100）；HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号 R312-02）；EazyTaq® DNA polymerase（北京全式金生物技术有限公司，货号 AP111）；dNTP mixtrue（上海生工生物工程股份有限公司，货号 B500056-0500）；Phanta® Max Super-Fidelity DNA Polymerase（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号 P505-d1）；Sca I-HF限制性内切酶（New England Biolabs，货号 R3122S），HiGeno 2x Probe Mix A（北京嘉诚生物科技有限公司，货号 E02/2019）；通用型 DNA 纯化回收试剂盒（北京金百特生物技术有限公司，货号 DC013）；RNase A（北京全式金生物技术有限公司，货号 GE101-01）；BM5000+ Marker（北京博迈德基因技术有限公司，货号 MD104）；CTAB，Tris/HCl，EDTA，NaCl，PVP，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，乙醇等常规试剂购买自北京中科裕博生物科技有限公司；实验所用引物合成自北京博迈德基因技术有限公司。
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2.2 实验方法
2.2.1 基因组 DNA 的提取
基因组DNA 的提取采用改良的 CTAB 法（DOYLE et al., 1987）。将两颗 5 mm 玻璃珠提前放入 2 mL 离心管中，收集幼嫩叶片于离心管中，迅速放入液氮冷冻，利用高通量组织研磨器研磨30 秒，加入 1 mL 2X CTAB 缓冲液，于 65℃水浴锅中温育 30 分钟后，加入 600 μL 预冷的氯仿/异戊醇（体积比为 24:1），充分混匀后 13000 rpm 离心 15 分钟，将 600 μL 上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，加入 5 μL RNase A，37℃恒温箱温育 15 分钟后，加入 600 μL 异丙醇，充分混匀，13000 rpm 离心 10 分钟，加入 70%乙醇清洗沉淀两次，待沉淀干燥后加入 100 μL TE-Buffer 溶解。利用 Nanodrop 2000 分光光度计测定 DNA 浓度，并通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。
2.2.2 总 RNA 提取
总 RNA 的提取使用北京金百特生物技术有限公司 RNAzol Reagent（货号 R011-100）。取新鲜叶片于 RNase Free 2 mL 离心管中，加入两颗 5 mm 玻璃珠，经液氮冷冻后于高通量研磨仪中迅速研磨后，加入 1 mL RNAzol Reagent，剧烈震荡后室温放置 5 分钟，加入 0.2 mL 氯仿，充分混匀后，于高速冷冻离心机中 4℃，13000 rpm 离心 15 分钟，将上清转移到新的 RNase Free 1.5 mL 离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置 10 分钟，于 4℃，13000 rpm 离心 10 分钟，使用 75%乙醇洗涤沉淀 2 次，晾干后加入 100 μL RNase Free water 溶解 RNA,并用 Nanodrop 2000分光光度计测定 RNA 浓度，并通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量。
2.2.3 RNA 反转录合成单链 cD NA
该实验采用南京诺唯赞生物科技有限公司 HiScript® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）试剂盒（货号：R312-02）。取 2 μL 总 RNA 于 RNase Free 离心管中，加入 2 μL RNase Free ddH2O，65℃加热 5 分钟，冰上静置 2 分钟，加入 1 μL 5X gDNA wipper Mix，42℃温育 2 分钟，加入 1 μL 10X RT Mix，1 μL HiScript III Enzyme Mix，0.5 μL Oligo (dT)20VN，0.5 μL Random hexamers 以及 2 μL RNase Free ddH2O，随后进行 25℃ 5 min，37℃ 45 min，85℃ 5 sec合成单链 cD NA。所有温育过程均在 PCR 仪中进行。
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第三章 结果与分析 ........................................ 23
3.1 全基因组关联分析鉴定 5H 关联位点 ....................................... 23
3.2 双亲分离群体验证抗病新遗传位点 ................................... 25
第四章 讨论 ............................................ 34
4.1 中国大麦品种资源中的黄花叶病抗性新位点 ......................... 34
4.2 结合全基因组关联分析和遗传连锁分析推进抗性新基因克隆 ........................... 34
第五章 全文结论 .......................... 37
第四章 讨论
4.1 中国大麦品种资源中的黄花叶病抗性新位点
大麦黄花叶病毒颗粒寄生在土壤真菌禾谷多黏菌的休眠孢子中，通过侵染植物根系进行传播，当环境条件不适宜时，休眠孢子可以保护病毒并使其维持毒力数十年之久，一旦环境适宜，则会大面积爆发。自上世纪 40 年代至今，该病害持续威胁着欧洲和东亚地区的冬大麦生产。由于其土传特性，常规的物理或化学防治方法（例如晚播，轮作，使用农药等）效果不明显，因此挖掘抗性基因，培育抗性品种是最经济有效的措施。
目前，国际上大麦黄花叶病抗性育种主要依赖于以下三个基因：来自于中国地方品种“木石港3 号”的 rym1/11 和 rym5 以及来自于巴尔干半岛地方品种‘Ragusa b’的 rym4（JIANG et al., 2020）。但是随着病毒株系的快速变异，rym4 已经被欧洲病毒株系 BaY MV-II 和日本病毒株系 BaYMV-3所克服，rym5 对 BaMMV-Sil 和 BaMMV-Teik 失去抗性（HABEKUSS et al., 2008; KüHNE et al., 2003; KANYUKA et al., 2004），广谱持久抗病基因 rym1/11 也对部分黄花叶病病毒株系（如 BaYMV-III）表现中抗。对中国流行病区主要病毒株系的抗病性鉴定结果发现，rym4、rym5 和 rym1/11 均丧失抗性（SHI et al., 2019）。因此，迫切需要挖掘新的抗性资源、分离抗性新基因，从而指导抗性育种。
在中国大麦品种资源中存在新型抗性基因有待克隆。上世纪 90 年代，徐阿炳等（1994）针对部分大麦黄花叶病免疫的中国地方品种，验证其所携带抗性基因的等位性。通过将“尺八大麦”与“木石港 3 号”进行正反交，在 F2 代均出现抗病单株与感病单株的分离，因此，“尺八大麦”与“木石港 3 号”携带的抗性基因是非等位的，即“尺八大麦”携带新型大麦黄花叶病抗性基因。
表 2-1 Multi-RT-PCR 所需引物
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第五章 全文结论
1. 通过对 900 份自然材料 2020 年扬州试验点抗病性调查的表型数据进行全基因组关联分析，验证了 5H 关联位点的重复性与可靠性，并且通过分析三年两点田间试验中鉴定到关联 SNP 位点不同基因型之间的病情指数差异，验证了 5H 关联位点的遗传效应。将 5H 染色体中部鉴定到的关联位点片段在大麦参考基因组中进行比对，发现该片段在 2H 染色体末端和 7H 染色体中部以及短臂末端均存在多处同源拷贝。
2. 将 5H 关联位点发展成为共显性 CAPS 分子标记，利用双亲群体 F2 个体定位到 7H 染色体短臂上，将其命名为 rym7H-1。由于 7H 染色体短臂尚未报道过有大麦黄花叶病抗性基因的存在，因此 rym7H-1 为一个抗性新基因。在 F4 代中借助遗传区间的侧翼标记和关联标记进行基因型鉴定，挑选出 rym7H-1 位点为抗病或感病基因型纯合的 F5 家系播种于病圃中进行病情指数调查，发现抗感家系的病情指数存在显著差异，由此此验证了 rym7H-1 位点的遗传效应。
3. 在 rym7H-1 目标区间内加密 KASP 标记并鉴定 400 份自然变异材料的基因型，结合其三年两点抗感表型数据，通过 T 检验计算目标区间内 KASP 标记与大麦黄花叶病抗性的关联显著性，在阈值为-log2(p) ≥ 15 的情况下，将关联置信区间限定在 7H 染色体短臂大约 500 kb 的物理区间内，结合 MorexV2 基因组注释数据，该区间包括 12 个高可信度基因和 16 个低可信度基因，排除低可信度基因和多拷贝基因，再结合基因的组织与时空表达分析和大麦泛基因组 20 个品种中的基因变异位点分析，最终选择其中 2 个候选基因优先进行功能验证。
参考文献（略）