本文是一篇药学论文，本研究收集了全国15个产地刺五加药材，建立了刺五加抗疲劳活性的谱效关系，筛选刺五加抗疲劳潜在有效成分，采用网络药理学工具阐明其作用机制，并采用绝对定量和相对定量的方式测定了15批次刺五加潜在有效成分的含量，建立了活性关联的刺五加质量评价体系。
1 绪论
1.1刺五加简介
刺五加（Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms）为五加科五加属多年生灌木，高1-6米，枝干上常有尖刺，刺针状，直而细长、向下，可开花结果，俗称坎拐棒子、老虎潦和一百针。刺五加喜温暖湿润气候，主要生长在海拔500~2000米的灌落叶阔叶林和针叶林中，目前刺五加生长地主要分布在我国东北地区、华北及华中地区，以及朝鲜、日本北部、俄罗斯远东地区[1,2]。刺五加干燥根、根茎或茎为刺五加药用部位，具有益气健脾，补肾安神的功效，在中医里刺五加具有悠久的药用历史[3]。现代药理学研究表明，刺五加主要影响心脑血管和神经系统，还具有增强免疫力、降低血糖、抗肿瘤等作用[4-6]。此外，还有研究表明，刺五加与人参在化学成分上具有很大相似性，这表明它们在一定程度上具有互相替代的潜力[7]。
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1.2 刺五加化学成分和药理作用研究进展
通过查阅文献发现，刺五加药用部位主要含有多糖、黄酮、苯丙素类、氨基酸及其他微量元素。其药理作用主要集中于心脑血管疾病、中枢神经系统作用、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等作用。现对刺五加主要化学成分及药理作用作以下概述。以下所提刺五加除特指外均指中国药典规定的刺五加药用部位，即根、根茎或茎。
1.2.1 刺五加化学成分研究进展
1.2.1.1 刺五加中多糖类成分
糖是指一类多元醇的醛或酮的衍生物，及它们的缩合物、衍生物的总称。根据其单糖分子数目的不同，可分为单糖、寡糖和多糖。由于多糖类成分结构复杂，表征困难，因此目前多糖结构研究主要集中于其一级结构，即糖类组成、糖苷键数量及种类、糖基的排列顺序等。刺五加多糖是刺五加主要活性成分，我国科学家徐任生等[8]从刺五加中分离提取得到两种多糖命名为PES-A和PES-B，分子量分别为7000和76000，进一步研究表明PES-A由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成，其分子比为33:2:1。白也明等采用水提醇沉法获得刺五加粗多糖，使其完全酸水解，经HPLC检测，结果表明组成刺五加多糖的还有木糖、果糖、半乳糖酸、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等[9]。范长友等采用水提醇沉法从刺五加根中提取刺五加多糖，HPLC法表征其单糖组成，发现刺五加多糖中还存在半乳糖四烯酸、岩藻糖等[10]。
1.2.1.2 刺五加中黄酮类成分
黄酮类化合物存在于自然界的大部分植物中，也叫黄酮体，化学结构上以C6-C3-C6为基本骨架。黄酮类化合物在植物中有两种存在形式：一种是通过与糖类结合为苷类化合物存在于植物体中，这是黄酮类化合物在植物体内存在的主要形式，一种是以单体形式游离于植物体中[11,12]。目前从刺五加根中分离得到12种黄酮类化合物，具体信息如表1-1所示。
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2 不同产地刺五加指纹图谱及共有峰鉴定研究
2.1 刺五加HPLC指纹图谱的建立
2.1.1 实验材料
收集全国15个不同产地的刺五加药材，经东北林业大学赵春建教授鉴定为中药刺五加(Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms)，编号、产地及收集时间如表2-1所示。刺五加产地分布及药材实物图分别如图2-1、2-2所示。
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2.2 刺五加指纹图谱共有峰LC-MS/MS鉴定
2.2.1 实验仪器与试剂
2.2.1.1 实验仪器
1260 Series型高效液相色谱系统（安捷伦科技公司），配四元泵、在线脱气及紫外检测器。6530 Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS/MS质谱（安捷伦科技公司）。其他实验仪器同2.1.2.1节。
2.2.1.2 实验试剂
甲醇、乙腈为MS级（德国Merck公司）；甲酸，MS级（美国Thermo Fisher公司）；水为娃哈哈水（娃哈哈集团有限公司）。 2.2.2 实验方法
2.2.2.1 供试品溶液的制备
选择25个共有峰峰面积均适中的9号样本（S9）进行LC-MS/MS检测。精密称取9号样本粉末1.0 g于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，密封，超声提取30 min，冷却至室温后，加入提取溶剂补足失去的重量，摇匀，离心，取上清，过0.22 µm微孔滤膜，弃去前2 mL，即得供试品溶液，4℃储存备用。
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3 不同产地刺五加抗疲劳活性及谱效关系研究 ....................... 27
3.1 刺五加抗疲劳活性研究 ............................ 27
3.1.1 实验材料 ....................................... 27
3.1.2 实验仪器 ........................................ 27
4 刺五加抗疲劳网络药理学研究 .......................... 46
4.1 实验材料 ...................................... 46
4.2 实验方法 ................................. 46
5 刺五加抗疲劳有效成分的定量分析研究 ............................. 56
5.1 刺五加中有效成分QAMS法的建立 .................... 56
5.1.1 实验材料 ........................................... 56
5.1.2 实验仪器与试剂 ................................... 57
5 刺五加抗疲劳有效成分的定量分析研究
5.1 刺五加中有效成分QAMS法的建立
一测多评法（Quantitative analysis of multi-components by single marker, QAMS）是王智民等于2006年提出一种多成分同步检测的方法，基于在一定线性范围，成分的量或浓度与其响应值成正比，以一个廉价、易得、稳定的成分作为内参物，建立其他成分与其相对校正因子（Relative Correction Factor, RCF），通过RCF即可计算出其他成分的含量，从而实现多种成分同步测定[137]。一测多评法可以很好的降低检测成本、减少有机溶剂消耗等优势逐渐得到认可，被广泛应用于中药质量标准控制的研究中[138-143]。以该法检测的松果菊、银杏、贯叶连翘等25个品种被收载于美国药典31版；欧洲药典5.0版收录了银杏叶、大蒜粉等9个以QAMS评价其质量标准的品种；以盐酸小檗碱为内标物建立黄连的QAMS质量评价被收载于《中国药典》2010年版中，且在2015年版中国药典中，采用该法评价其质量的品种数增加至9个[144]。
5.1.1 实验材料
刺五加苷B（批号：MUST-19120510）、刺五加苷E（批号：MUST-20062402）、异嗪皮啶（批号：MUST-20070710）、咖啡酸（批号：MUST-20032003）对照品（HPLC级，纯度>99%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司。其他成分（5-(4-O-β-D葡萄糖基阿魏酰)-奎宁酸、(+/-)13-HODE松脂醇二葡萄糖苷或其异构体、7,8-二氢去氢二松柏醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、开环异落叶松脂醇4-O-β-D-葡萄糖苷）的对照品难以获得，因此，其含量采用相对定量。
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结论
本研究收集了全国15个产地刺五加药材，建立了刺五加抗疲劳活性的谱效关系，筛选刺五加抗疲劳潜在有效成分，采用网络药理学工具阐明其作用机制，并采用绝对定量和相对定量的方式测定了15批次刺五加潜在有效成分的含量，建立了活性关联的刺五加质量评价体系。得到的主要结论如下：
（1）建立了刺五加指纹图谱并识别共有峰
建立了15个产地刺五加HPLC指纹图谱，以S1样本为参照图谱时，其相似度在0.533~0.992之间，通过自动校正和手动校正的方式匹配了25个共有峰，采用LC-MS/MS技术成功辨识出其中22个共有峰，对25个共有峰峰面积进行主成分分析，发现S4、S11、S15样本之间差异较大。
（2）探明了刺五加抗疲劳谱效关系
制备了15批次刺五加提取液，通过小鼠负重游泳实验考察其抗疲劳活性，通过GRA和PLSR联用建立刺五加抗疲劳谱效关系，结果表明咖啡酸、5-(4-O-β-D葡萄糖基阿魏酰)-奎宁酸、(+/-)13-HODE、异嗪皮啶、刺五加苷E、刺五加苷B、松脂醇二葡萄糖苷或其异构体、7,8-二氢去氢二松柏醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、开环异落叶松脂醇4-O-β-D-葡萄糖苷是潜在的有效成分
（3）应用网络药理学探究了刺五加抗疲劳潜在机制
通过网络药理学工具构建了刺五加潜在有效成分与抗疲劳之间的靶点网络，对网络进行拓扑分析，对核心靶点进行GO分析和KEGG分析，结果显示刺五加抗疲劳核心靶点可能为HIF1A、VEGFA、NOS3、PPARG、PTGS2，作用涉及神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触、钙信号、cG MP-PKG信号等通路。
（4）成功建立活性关联的刺五加质量评价体系
基于抗疲劳活性将刺五加分为三个等级，采用一测多评法测定了15批次药材中刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶、咖啡酸的含量，定义前20%为一等品，前20%~80%为二等品，其余为三等品。建立了基于活性的刺五加质量评价体系。
参考文献（略）