第一部分 乙酰胆碱修饰硫化铜纳米片用于实现靶向肺部/皮肤细菌感染的低功率光热/光动力协同治疗
1 实验部分
1.1 仪器
使用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）（FESEM，Hitachi，SU820，3.0 kV）和场发射透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）（FETEM，FEI，Tecnai G2 F20，200 kV）分析 Ach-CuS NSs 的微观形貌和表面结构。使用 Bruker AXS, Bruker Dension Icon 原子力显微镜（Atomic force microscope，AFM）分析 Ach-CuS NSs 的微粒厚度与粗糙度。通过 XRD-6100 X 射线衍射仪上的 X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）分析 CuS NSs 的晶体结构和相纯度。电子顺磁共振（Electron paramagnetic resonance，EPR）光谱由 Bruker A300-10/12 电子顺磁共振波谱仪测得。紫外可见吸收光谱由 Shimadzu UV‒2600 紫外可见分光光度计测得。荧光光谱由 Shimadzu RF-5301PC 荧光分光光度计测得，并且用尼康A1-R 激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）测得荧光图像。FLIR E6XT 红外热成像仪和 Lutron TM-917 电子温度计用于获得热像图和溶液温度。凝血实验在 SYSMEX CS-5100 自动凝结分析仪上进行。使用 Varioskan3020 TY2019001949 微孔结构分析仪测量细胞毒性实验中样品的吸光度。用尼康ECLIPSE Ci-L 立式生物显微镜观察组织切片。含有细胞的孔板放在 Thermo Forma311 CO2 培养箱中培养
1.2 试剂材料
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑，内盐（MTS），二甲亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），细胞培养基（DMEM）购自 Saimike Bio-Tech 有限公司（中国重庆）。吖啶橙（Acridine Orange，AO），溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB），无水乙醇，多聚甲醛购自 Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP（MW = 55000）），硫（Sulfur，S），二甘醇（Diethylene glycol，DEG），五水硫酸铜（CuSO4·5H2O），丙酮，乙醚，氯化钠（NaC l）购自川东化工有限公司（中国重庆）。Luria-Bertani（LB）肉汤培养基，LB 琼脂培养基、氯化乙酰胆碱购自生工生物有限公司(中国上海)。 三磷酸腺苷（Adenylate triphosphate，ATP）检测试剂盒（产品编号 S0026）购自碧云天生物技术有限公司（中国上海）。白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（产品编号 556231、887745、002536）购自欣博盛生物科技有限公司（中国深圳）。二喹啉酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（产品编号 PC0020-500 微孔）购自索莱宝生物科技有限公司（中国上海）。实验中用水均为超纯水（18.2 MΩ）。健康人的静脉血，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC 43300），大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli，ATCC 25922），沙门氏菌（Salmonella，ATCC 14028），肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae，临床野生株），鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，A. baumannii，临床野生株）取自重庆医科大学附属大学城医院。
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2 结果与讨论
2.1 功能化修饰硫化铜纳米片的表征
利用水热法获得了具有良好生物相容性和水溶性的 CuS 纳米晶体。X 射线衍射（XRD）图谱（图 1.1d）显示所有峰均与 CuS 的标准图谱（JCPDS No.06-0464）吻合，表明获得了具有高纯度和良好结晶度的 CuS 纳米晶体。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像（图 1.1a-b）显示，Ach-CuS 纳米晶体呈六角形片状结构。Ach-CuS NSs 的平均边缘长度和厚度分别为 100.2 ± 24.3 nm 和10.3 ± 0.3 nm，印证了它的二维片状结构（图 1.1b-内嵌图和图 1.1c-内嵌图）。图1.2a 中，对比 CuS NSs，修饰后得到的 Ach-CuS NSs 在 220 nm 左右的最大吸收峰向右偏移了 10 nm，表明乙酰胆碱成功修饰在了 CuS NSs 表面。
Ach-CuS NSs 成功合成后，我们对它的化学性质进行了摸索。首先，我们选择了一种模型细胞内化合物谷胱甘肽作为一种氧化应激指示剂，用于指示 Ach-CuSNSs 是否发生了氧化应激反应。图 1h 所示，在有氧条件下，经 Ach-CuS NSs、Ach-CuS NSs+Laser 处理后的谷胱甘肽含量明显下降。在氮气条件下，水中溶解氧减少，Ach-CuS NSs、Ach-CuS NSs+Laser 处理后谷胱甘肽的损失远低于有氧条件下的损失，表明缺氧时谷胱甘肽的氧化受到了很大的抑制。结果表明 Ach-CuS NSs可以催化化学氧化，为了进一步证实这种氧化的来源，我们采用电子顺磁共振（EPR）光谱表征了 Ach-CuS NSs 是否能产生 ROS。图 1.1e-g 结果表明，Ach-CuSNSs 在不存在激光的情况下触发了超氧阴离子（O2-·）的产生，且在激光辐照 5 min后增加了两倍。而1O2、·OH 可以在 808 nm 激光辐照下产生，并随着辐照时间从 5分钟增加到 10 分钟，含量明显增加。这是由于在没有激光的情况下，CuS 可催化分子氧形成 O2-·，而激光可以通过加速 Haber-Weiss 反应的动力学来形成更多的ROS（O2-·、1O2、·OH）[34,48]。
药学论文参考.
第二部分 功能化四氧化三锰纳米片光热/光动力协同作用治疗多重耐药菌感染
1 实验部分
1.1 仪器
电子顺磁共振（EPR）光谱由 Bruker A300-10 / 12 电子顺磁共振波谱仪测得。紫外可见吸收光谱由 Shimadzu UV-2600 紫外可见分光光度计测定。扫描电子显微镜（SEM）（FESEM，Hitachi，SU820，3.0 kV）用于观察细菌形态。荧光光谱由 Shimadzu RF-5301PC 荧光分光光度计测定，并且使用尼康 A1-R 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）获得荧光图像。FLIR E6XT 红外热成像仪和 LutronTM-917 电子温度计用于获得热像图和溶液温度。尼康 ECLIPSE Ci-L 立式生物显微镜用于观察组织切片。
1.2 试剂材料
吲哚菁绿（ICG），吖啶橙（AO），溴化乙锭（EB），碘化丙啶（Propidiumiodide，PI），无水乙醇，多聚甲醛购自 Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。一水合肼（N2H4·H2O，85%）购自科隆化工有限公司（中国成都）。高锰酸钾（KMnO4，≥99.5%）乙醇，丙酮，乙醚，氯化钠购自川东化工有限公司（中国重庆）。Luria-Bertani（LB）肉汤培养基，Luria-Bertani（LB）琼脂培养基，氯化乙酰胆碱购自生工生物有限公司(中国上海)。健康人的静脉血，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC 43300），大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli，ATCC 25922），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa，ATCC 27853），粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E. faecalis，ATCC 29212）取自重庆医科大学附属大学城医院。
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2 结果与讨论
2.1 光热性能评价
Mn3O4HNSs 表面用ICG 修饰，ICG是 FDA批准用于临床的安全光敏剂（λmax=780 nm）。如图 2.1a 中的 UV-vis 光谱所示，ICG（紫线）在 217、710 和 778 nm处具有三个特征吸收峰。与原始 Mn3O4HNSs 相比，经 ICG 修饰后的 Mn3O4HNSs还在 220 nm 处出现了一个新峰。该结果证明了 Mn3O4HNSs@ICG 的成功制备。当暴露于功率密度为 0.33 W/cm2 的 808 nm 激光下，Mn3O4HNSs@ICG 溶液的温度随着辐射时间和 Mn3O4HNSs@ICG 浓度的增加而升高，这表明它们具有优异的光热性能。如图 2.1b 所示，当加入 1.5 mg/mL Mn3O4HNSs@ICG，溶液温度在5 分钟内从室温升至 50℃ 以上。随着激光功率密度的增加，溶液的温度急剧增加（甚至在 2 W/cm2 时接近 80℃）（图 2.1c）。在一些已报道的文献中使用了大于 1 W/cm2 的功率密度来达到良好的光热效果，但是，局部高热量可能会对皮肤裸露区域引起红斑，水泡等损伤[19,63]。考虑到光热疗法的安全性，根据美国激光安全使用标准（ANSI Z136.1-2014），我们在本研究中使用的功率密度为 0.33W/cm2。Mn3O4HNSs@ICG 的光热转换效率（η）经计算为 67.5%（图 1.2d 和内嵌图），远高于大多数报道的 PTT 材料[50, 51]。
药学论文怎么写
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第二部分 功能化四氧化三锰纳米片光热/光动力协同作用治疗多重耐药菌感染.. 44
1 实验部分................................ 44
1.1 仪器......................................... 44
1.2 试剂材料.................................. 44
1.3 功能化四氧化三锰纳米片的合成........................ 44
1.4 光热性能评价....................................... 45
1.5 活性氧的测量................................... 45
1.6 溶血实验....................................... 45
全文总结................................. 64
3 小结
总之，我们基于光敏剂功能化的具有粗糙表面的 Mn3O4 纳米片设计了PTT/PDT 协同抑菌平台。这种纳米材料可以有效地将近红外光转换为热能（光热转换效率为 67.5%），同时生成三种 ROS（1O2，O2-·，·OH）以实现在单个低功率 808 nm 激光（0.33 W/cm2）辐照下的 PTT/PDT 协同抑菌。具有粗糙表面的片状结构使这种纳米材料倾向于粘附在细菌表面，并破坏其膜系统。依靠这些优势，基于 Mn3O4 的抑菌平台可在体内外有效杀灭 MRSA。伤口愈合结果表明，这种协同抑菌策略可以彻底清除伤口上的 MRSA，并且在体内促进胶原纤维合成和完整表皮的再生。机制研究进一步揭示了 Mn3O4HNSs@ICG 对细菌膜系统的破坏性，这归因于在近红外激光辐照下产生的局部高温和 ROS。此外，体内外毒性评估充分证明了这种纳米材料以及单个低功率激光长期辐照的生物安全性。这项工作基于 Mn3O4HNSs@ICG 诱导的 PTT/PDT 协同策略提供了一种多功能，安全且有效的抗菌方法，有望在未来与病原微生物感染作斗争。
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全文总结
本研究成功地合成了高效、稳定、低毒的抗菌剂乙酰胆碱修饰硫化铜纳米片，结合了靶向/光热/光动力三联疗法，克服了传统 PDT/PTT 联合治疗需要较大功率密度的激光长期辐照和两个不同波长的激光源依次辐照的缺点。该抗菌方法对不同致病菌包括多重耐药菌（如 MRSA）在内都有显著抗菌效果，可消除细菌生物膜和减轻炎症反应，从而治疗 MRSA 感染导致的小鼠皮下脓肿和细菌性肺炎。
本研究成功制备了吲哚菁绿功能化四氧化三锰六角纳米片，可以有效地将近红外光转换为热能（光热转换效率为 67.5%），同时生成三种 ROS（1O2，O2-·，·OH），在功率密度低至 0.33 W/cm2的单个 808 nm 激光辐照下显示出对多重耐药菌的显著抗菌活性。体内外毒性评估充分证明了这种纳米材料以及单个低功率激光长期辐照的生物安全性。伤口愈合结果表明，这种协同抑菌策略可以彻底清除伤口上的 MRSA，并且在体内促进胶原纤维合成和完整表皮的再生，对多重耐药菌感染的伤口有显著的治疗效果。
总之，本文基于两种二维纳米片——乙酰胆碱修饰硫化铜纳米片和吲哚菁绿功能化四氧化三锰六角纳米片，开发了两种有效的抗菌方法，可在短时间内实现单激光低功率 PTT/PDT 协同抑菌。不仅可治愈浅部细菌感染（如皮下脓肿），对深部器官感染（如细菌性肺炎）也有显著的疗效，这种低功率单激光器可激活的靶向 PDT/PTT 联合策略有望在未来替代抗生素与多重耐药菌感染作斗争。
参考文献（略）