第 1 章 综述
1.1 旋覆花概论
旋覆花属出自菊科，是一种庞大的植物属，由一百多个品种组成。其分布范围也极其广泛，非洲、亚洲、欧洲均有它们的身影。在世界各地的药典中旋覆花作为一种传统药物，用于多种疾病的治疗。在中国广袤的土地上生长着 20余种旋覆花属植物，我国古代的药学著作中也早有对旋覆花药用的记载。例如黄连上清片中就含有旋覆花[1]。如今旋覆花的价值正在不断被开发，抗溃疡药物、吸烟者糖浆等应运而生[2-3]。科学家期待它为人类的健康做出更大的贡献。
1.1.1 旋覆花属植物在传统医药中的应用
植物作为药物治疗各种疾病的历史几乎贯穿于人类进化的全过程。在当代医学没有得到高度发展的时代，人们便开始探寻草药的药用价值，甚至它们当中的很多，现如今依然广泛应用于临床。旋覆花属植物就是一大类从传统医药中走出来的药用植物。中国传统医药典籍中详细记载了旋覆花（亦称欧亚旋覆花）、金飞草、土木香等，旋覆花属植物具有化痰、止咳、解表、止吐和抗菌的作用。特别是湖北旋覆花在民间被用于治疗支气管炎、糖尿病和肠溃疡[4]。
羊耳菊是雅叫哈顿散的一个重要组成部分，它是傣族著名的药方，用于治疗发热、腹胀和月经不调[5]。同时羊耳菊的空气根也被用于治疗风湿性关节炎、疟疾、痢疾和肝炎[6]。羊耳菊的叶子的汁水被印度喜马拉雅地区米佐拉姆土著社区的居民用来治疗黄疸[7]。也有中国民间医学使用它来治疗风湿、气管炎及腹痛[5, 8]。
金钱花生长在南迪瓦尔库瓦尔河流域的巴基斯坦一代，传统医学中将其作为高血压的治疗药物[9]。它与钝叶旋覆花和总状土木香一起作为旋覆花属中的佼佼者，具有多种活性，例如驱虫、防腐、祛痰、利尿、降压和促消化的作用[10]。在西藏的传统医学中钝叶旋覆花可用于治疗胃肠道、咽喉感染和类风湿性关节炎[10]。在印度的阿育吠陀药典中有关于总状土木香的记载，其根研成粉末用于治疗哮喘、降低胆固醇和血糖、缓解心绞痛和呼吸困难[11,12]。而在中国总状土木香也被称为“玛奴”，长期用于调节胃肠功能、镇痛和抗菌[13]。
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1.2 肝癌及其相关凋亡通路的研究
1.2.1 肝癌的流行病学研究
原发性肝癌以肝细胞癌为主。世界范围内，肝癌在所有癌症相关死亡中位居第四，发病率在第六位（Fig1.1）[69]。根据世界卫生组织的预测，到 2030 年全世界将有 100 多万人死于肝癌。我国的新发肝癌病例数占全球肝癌发病的46.6%。2016 年我国肝癌所致伤残为每年 1153.9 万人，位居全部恶性肿瘤第 2位[70]。可见我国防控肝癌的压力巨大。大部分肝癌的发生都与肝的潜在疾病相关，例如乙、丙型肝炎病毒的感染或酗酒。乙肝疫苗的普及和丙肝抗病毒药物的发展，使肝癌的病因学发生了改变。然而非酒精脂肪性肝病的增加，以及代谢综合征和肥胖共同增加了患肝癌的风险，目前这已经成为我们所面临的新问题[71]。
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第 2 章 实验研究 1, 6-O, O -二乙酰旋覆花内酯含量并进行药物动力学研究
2.1 液相色谱-串联质谱法定量分析大鼠血浆中 1，6-O,O-二乙酰旋覆花内酯含量并进行药物动力学研究
2.1.1 实验材料和仪器
2.1.1.1 实验药品
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2.2 OODBL 通过多种通路诱导肿瘤细胞凋亡
旋覆花属植物具有多种生物学活性，并且广泛用于传统医学当中，随着医学的不断发展，学者将旋覆花属植物当中的有效成分提取研究，发现倍半萜内酯作为其中重要的一种代谢产物，在抗肿瘤方面表现出良好的作用。例如木香烃内酯能够诱导 HL-60 细胞中的 Bax 上调，Bcl-2 下调，进而激活 Caspase-3 诱导细胞内源性凋亡途径[149]，同时在 MDA-MB-231 细胞中通过激活 JNK 表达的Fas-L 配体，随后激活外源性细胞凋亡途径。同样的 1, 6-O, O-二乙酰旋覆花内酯在以往的研究中发现作用 HL-60 细胞后能增加 ROS 的产生，导致 MAPK 和JNK 通路激活[31]。说明旋覆花属植物中提取的倍半萜内酯可以通过多种细胞通路诱导细胞凋亡的产生（如图 2.2.1）。本章实验将研究参与 OODBL 诱导的细胞凋亡的通路，为其抗肿瘤作用的机制提供理论基础。
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2 章 实验研究 1, 6-O, O -二乙酰旋覆花内酯含量并进行药物动力学研究..........................24
2.1 液相色谱-串联质谱法定量分析大鼠血浆中 1，6-O,O-二乙酰旋覆花内酯含量并进行药物动力学研究...........24
2.1.1 实验材料和仪器.................................. 24
2.1.2 方法学验证................................. 27
第 3 章 结论与展望............................. 66
结论：
1．本论文首先利用液相色谱-串联质谱法检测 OODBL 并在大鼠体内进行了初步的药代动力学研究。与文献和现有参考标准对比分析，本文所建立方法的精密度和准确性满足了 FDA 制定的生物样本分析的标准，为 OODBL 检测提供了灵敏可靠的新方法。在药代动力学研究中，通过对不同剂量 OODBL 的最大血浆浓度（Cmax）、曲线下面积（AUC）、相应的达峰时间（Tmax）、消除半衰期（t 1/2）、平均滞留时间（MRT）和总清除率（CI）等参数的对比分析也显示目前的方法对于 OODBL 灵敏度的分析得到了显著提高。而且，这种新颖的LC-MS-MS 方法的成功应用，将为后续对 OODBL 的药代动力学的深入研究奠定基础，也为 OODBL 的开发与临床应用提供理论依据。
2．体外细胞实验结果表明，OODBL 作为一种旋覆花中提取的倍半萜内酯，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并能明显抑制 HepG2 肝癌细胞的增殖，促进HepG2 细胞的凋亡。使用流式细胞仪进行的细胞凋亡及细胞周期检测、线粒体膜电位检测，采用 Western Blot 进行的凋亡相关蛋白及其磷酸化检测，细胞的克隆形成实验都从不同角度证实了 OODBL 诱导 HepG2 肝癌细胞凋亡的作用与机制。其中 Bcl-2 家族不仅通过上调促凋亡蛋白的表达、下调抑制凋亡蛋白的表达来诱导凋亡，还通过引发 Bcl-2 的磷酸化参与了 OODBL 对 HepG2 细胞增殖的抑制的作用，其与紫衫酚同样作用于有丝分裂密切相关的 Bcl-2 的丝氨酸70 和 87 位点。荧光染色、内质网应激的特征性蛋白 IRE1α、GRP78、CHOP 检测及其 RNA 干扰实验进一步揭示内质网应激也参与了 HepG2 细胞凋亡的过程。而 ROS 抑制剂的使用，则证明了 ROS 作为这两种凋亡方式的上游激活因子发挥作用。
3．体内裸鼠成瘤实验结果显示皮下注射阿霉素（DOX）和 OODBL 后，瘤体积随着时间而逐渐缩小，而注药两周后 OODBL 组与对照组相比瘤体明显减小，具有显著的统计学差异（P≤0.05），证实了 OODBL 在体内的抗肿瘤作用，为后续药物的体内作用机制及靶点研究提供科学指导。
参考文献（略）