第一节 ZBTB4 在乳腺癌细胞中的表达及临床意义
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞系
人乳腺癌细胞(管腔型)系 MCF-7 （American type culture collection, ATCC,Manassas, VA, USA)。肿瘤组织切片来源于宜春市人民医院知情患者，并经医院伦理委员会批准。
1.1.2 药品和试剂
药品和试剂
1.2 实验方法
1.2.1 实验细胞培养
(1) 选用管腔型乳腺癌细胞系 MCF-7 进行培养和后续实验；
(2) 用包含 1%的青霉素和链霉素（双抗）以及 10%的 FBS（牛血清）的 DMEM培养液培养，并放在 5% CO2的饱和湿度的 37 °C 的恒温培养箱中；
(3) 观察细胞密度，约为 80～90%左右时弃去培养皿中的上清液，用不含 Ca、Mg 的 PBS 1 mL 洗 2 次，然后再加 1 mL 胰酶（0.25%）后置于上述恒温培养箱中，2min 后取出，在显微镜下观察皿内细胞被消化的进程，视情况拿回无菌操作台后加 1mL 以上含 10%血清的培养基终止消化；
(4) 收集细胞至新的离心管，1000 rpm 离心 5 min，弃上清后加入 1 mL 培养液，混匀重悬。并将细胞悬液根据细胞密度按 1:2 到 1:5 的比例分到新的含 7 mL 培养液的干净皿中备用，
(5) 用配置好的细胞冻存液保存剩余的细胞；
(6) 细胞复苏：将冻存管取出后迅速在 37 °C 水浴中解冻，再用适量培养液将其混均，1000 rpm 离心 5 min 后弃上清，然后用 2 mL 培养液轻轻吹匀后分于含培养液的新皿中培养，第二天检查细胞贴壁情况和融合率并换液。
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第二节：ZBTB4 对乳腺癌细胞恶性进展和代谢的影响
2.1 实验材料
2.1.1 实验细胞系
同第一节。
2.1.2 实验动物
异种移植瘤模型所用小鼠为的 Ba1b/c 系雌性小鼠（SPF 级），为鼠龄 4 周、体重约为 20-22 g 的健康小鼠（湖南斯奈科景达实验动物有限公司）。
2.1.3 药品与试剂
药品与试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
方法操作同第一节。
2.2.2 质粒转染
过程同第一节部分。用空载体和两种不同的 ZBTB4 sh-RNA 质粒瞬时敲低了过表达 ZBTB4 的乳腺癌细胞中 ZBTB4 的表达，并进行体外功能测定。
2.2.3 蛋白免疫印迹实验
实验方法与具体步骤与第一节的叙述一致，并设内参。
2.2.4 细胞增殖实验（CCK-8）
（1）收集管腔型乳腺癌细胞MCF-7，用1 mL PBS洗2遍后加入0.25%的胰酶1 mL培养箱内消化 2 min，离心后弃废液，用培养 1 mL 混匀后离心，弃上清，加培养液，重悬，细胞计数后根据需要调整细胞浓度并接种于无菌 96 孔板；
（2）设空载体对照组，转染 ZBTB4 者为实验组，并各设 5 个复孔，重复 3 次；
（3）孵育时间到后，弃去上层培养液后吸取 PBS 洗 2 次；
（4）在每孔中加入浓度为 5 mg/mL 的 CCK-8 溶液 10 μL（注意尽量避免产生气泡），将板放入 37 °C 的 CO2培养箱培养 4 h；
（5）取出上述的 96 孔板，吸去上清后依次加入 DMSO 150 μL/孔，然后（室温）震摇半小时至结晶溶解；
（6）将孔板置于酶标仪，测定 450 nm 处各孔的 OD 值，计算该细胞的增殖率并保存结果。
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第三节：ZBTB4 影响乳腺癌他莫昔芬耐药细胞敏感性.............................17
3.1 实验材料........................................17
3.1.1 实验细胞..............................17
3.1.2 实验动物..................................17
第四节：ZBTB4 调控乳腺癌细胞增殖、代谢和耐药性的机制.................22
4.1 实验材料...........................22
4.1.1 实验细胞系................22
4.1.2 实验动物...................................22
讨论..................................30
第四节：ZBTB4 调控乳腺癌细胞增殖、代谢和耐药性的机制
4.1 实验材料
4.1.1 实验细胞系
同第一、二、三节。
4.1.2 实验动物
异种移植瘤模型所用实验动物为裸鼠，具体同第一、第二节。
4.1.3 药品与试剂
药品与试剂
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讨论
乳腺癌具有一种明显异质性特点，不仅发病率高，侵袭性也强，还极易发生转移和复发。虽然目前乳腺癌的治疗治愈率和总体生存率明显提高，但随着耐药率的升高，以及其带来的相关不良反应，使得改善乳腺癌患者化疗耐药和预后情况成为了亟待解决的难题。越来越多的证据表明，乳腺癌恶性进展与其特定的代谢异常有关，特别是糖酵解和谷氨酰胺代谢。代谢方式的转变也有助于调节化疗抗性，作为克服化疗抗性的策略，多种抑制关键代谢途径的化合物作为增强临床乳腺癌疗效的靶向纷纷涌现，并进入临床实验。ZBTB4 是一种新型 POZ 域 Kruppel 样锌指转录遏制物。据知，POZ 域蛋白参与许多重要的细胞过程，如细胞凋亡[13]。某些 POZ 域 Kruppel 样锌指（POK）蛋白是发育、分化和肿瘤发生的决定因素，其共同特性就是通过其 N 端保守区（POZ 域）抑制转录的能力，例如 FBI-1（也被称为 ZBTB7A）可以通过抑制肿瘤抑制因子 ARF及 Rb 的转录活性[14]。
ZBTB2 被证明是 p53 途径的潜在致癌主调控基因，主要通过与共轭因子如 BCoR、NCoR 以及 SMRT 交互而发挥作用[15]。ZBTB5 通过调节 p53 途径中的 P21 和 HDM2 转录调控肿瘤细胞生长、分化和凋亡等[16]。此外，该家族还发现与葡萄糖稳态与淋巴系统发育的调节有关[17、18]但目前关于 ZBTB4 的研究尚处于基础试验阶段。在本研究中，我们检测了 ZBTB4 在乳腺癌中的表达状况及其与临床患者生存率的关系。我们以管腔型乳腺癌细胞系 MCF-7 为研究对象，通过蛋白免疫印迹进一步证明其在乳腺癌细胞的低表达，通过脂质体转染 ZBTB4 构建过表达 ZBTB4的乳腺癌细胞系用于后续试验。
参考文献（略）