第一部分 四制香附炮制前后 UPLC 指纹图谱比较
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要仪器
超高效液相色谱仪（岛津公司，LC-30AD型），1/10万电子分析天平（Mettler Toledo公司，XS205DU型），1/1万电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA124S-CW型），电子天平（上海衡平仪器仪表厂，JY-5002型），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ5200型），手提式高速万能粉碎机 （温岭市林大机械有限公司，DFT-50A型）。
1.1.2 试剂与药材
香附烯酮（批号CHB180315），α-香附酮（批号CHB180316），5-HMF（批号CHB180118）对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均≥98%；米醋（江苏恒顺醋业股份有限公司，批号GB/T18187），黄酒（上海金枫酒业股份有限公司，批号GB/T13662 ），净制食用盐（中盐长江盐化有限公司，批号GB/T5461），白酒，生姜，炼蜜，红糖均购于鲜汇超市，水为娃哈哈纯净水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。17批不同产地香附药材经中国中医科学院中药研究所王祝举研究员鉴定为莎草科植物莎草 Cyperus rotundus L.的干燥根茎，具体信息见表1-1。
表1-1 17批香附药材信息
Shim-pack GIST C18（2.1 I.D×100 mm，2 μm），流动相甲醇-水（0~10 min， 5%~40%；10~30 min，40%~70%；30~40 min，70%），检测波长280 nm，流速0.3 mL·min-1，进样量3 μL，柱温35°C。
................................
2 结果
2.1 方法学考察结果
2.1.1 精密度试验
以27号色谱峰为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均＜3.0%，表明仪器精密度良好。
2.1.2 稳定性试验
以27号色谱峰为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均＜3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。 2.1.3 重复性试验 以27号色谱峰为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均＜3.0%，表明该方法重复性良好。
2.2 香附和四制香附指纹图谱的评价
2.2.1 相似度评价
15 批香附的 UPLC 指纹图谱见图 1-1 ，与其对照图谱之间的相似度处于0.976~1.000；15批四制香附的UPLC指纹图谱见图1-2，与其对照图谱之间的相似度处于0.979~0.998，结果见表1-2。香附和四制香附的特征图谱见图1-3。通过图谱对比后发现，峰1，2，4为四制香附的特有峰，峰5为香附的特有峰，其余24个峰为两者的共有峰；经对照品比对初步确认峰1为DDMP，峰2为5-HMF，峰24为香附烯酮，峰27为α-香附酮。将辅料图谱与香附、四制香附的图谱进行比对，结果发现米醋和黄酒中也有明显的5-HMF色谱峰，提示四制香附中的这个成分有可能来源于米醋和黄酒。
表1-2 15批香附和四制香附UPLC指纹图谱相似度
第二部分 UPLC 测定四制香附炮制前后指标成分含量
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要仪器
超高效液相色谱仪（岛津公司，LC-30AD型），1/10万电子分析天平（Mettler Toledo公司，XS205DU型），1/1万电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA124S-CW型），电子天平（上海衡平仪器仪表厂，JY-5002型），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ5200型），手提式高速万能粉碎机 （温岭市林大机械有限公司，DFT-50A型）。
1.1.2 试剂与药材
香附烯酮（批号CHB180315），α-香附酮（批号CHB180316），对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均≥98%；米醋（江苏恒顺醋业股份有限公司，GB/T18187），黄酒（上海金枫酒业股份有限公司，GB/T13662），净制食用盐（中盐长江盐化有限公司，GB/T5461），白酒，生姜，炼蜜，红糖均购于鲜汇超市，水为娃哈哈纯净水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。药材同第一部分1.1.2项下。
1.2 色谱条件
Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 I.D×100 mm，2 μm），流动相甲醇-水（75:25），流速0.3 mL·min-1，检测波长242 nm，进样量3 μL，柱温35°C。
1.3 香附及四制香附饮片的制备
香附饮片的制备参考2020年版《中国药典》（一部）“香附”项下香附饮片的制法。将香附药材除去毛须及杂质，碾碎，即得。四制香附饮片的制备参考2020年版《中国药典》（一部）“抱龙丸”项下香附（四制）的炮制方法。即取净香附200 g，用酒、醋、姜汁各12 g和盐4 g的混合液体拌匀，闷润12 h，取出，蒸3 h至透心，取出，晒干，即得。
..........................
2 结果
2.1 方法学考察结果
2.1.1 线性关系考察
以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，得香附烯酮和α-香附酮的回归 方 程 分 别 为 Y=8762031.8068 X+32483.8778 (r=0.9994) ， Y=9646063.4637 X+40479.4766 (r=0.9997)，线性范围分别为0.01458~0.2916，0.01776~0.3907 μg，结果表明这2个化合物在给定的线性范围内线性关系良好。
2.1.2 精密度考察
香附烯酮和α-香附酮峰面积的RSD分别为0.44%，0.71%，均＜3.0%，表明仪器精密度良好。
2.1.2 重复性试验
香附烯酮，α-香附酮的质量分数分别为1.1650，1.6744 mg·g-1，RSD分别为0.45%，0.47%，均＜3.0%，表明该方法的重复性良好。
2.1.3 稳定性试验
香附烯酮和α-香附酮峰面积的RSD分别为1.19%，1.05%，均＜3.0%，表明该供试品溶液在24 h内的稳定性良好。
2.1.4 加样回收率试验
香附烯酮和α-香附酮的平均加样回收率分别为102.92%和96.40%，RSD均＜3.0%，结果见表2-1，表明该方法具有可行性。
表2-1 加样回收率考察结果
第三部分 基于颜色-成分分析比较香附四制前后差异 ..........................................24
1 材料与方法 .............................25
2 结 果 ....................................26
3 讨 论 ..................................................28
第四部分 四制香附炮...........................29
1 材料与方法 ..........................................29
2 结 果 ..................................32
3 讨论 ..................................................34
第五部分 四制香附炮制前后其他检测项目比较 ....................................................34
1 材料和方法 ........................................35
2 结果 .........................................37
3 讨论 .....................................37
第七部分 UPLC 测定蒸陈皮中指标成分含量
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要仪器
LC-30AD型超高效液相色谱仪（岛津有限公司），DFT-50A型手提式高速万能粉碎机 （温岭市林大机械有限公司），XS205DU型1/10万电子分析天平（Mettler Toledo公司），BSA124S-CW型1/1万电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），JY-5002型电子天平（上海衡平仪器仪表厂），KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.1.2 试剂与药材
芸香柚皮苷（批号CHB180917），橙皮苷（批号CHB201220），川陈皮素（批号CHB180529），桔皮素（批号CHB190125）对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司，纯度均≥98%；水为娃哈哈纯净水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。药材同第六部分1.1.2项下。
1.2 色谱条件
Shim-pack GIST C18色谱柱（2.1 I.D×100 mm，2 μm），流动相乙腈-0.1%甲酸水（0~7 min， 20%~48%；7~15min，52%），流速0.3 mL·min-1，nm，进样量3 μL，柱温30°C。
1.3 陈皮及蒸陈皮饮片的制备
药材，除去杂质。蒸陈皮饮片的制备方法参考《四川省中药饮片炮制规范》（2015年版）“陈皮”项下蒸陈皮饮片的制法。取陈皮，除去杂质，湿润后，照蒸法（通则0213）蒸透，取出，切丝，晒干。
1.4 供试品溶液的制备
取陈皮粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min，放冷，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
.............................
第八部分 基于颜色-成分分析比较陈皮蒸制前后差异
总结
香附和四制香附的指纹图谱中共标示了28个特征峰，其中峰1，2，4为四制香附的特有峰，峰5为香附的特有峰，经指认峰1为DDMP，峰2为5-HMF，峰24为香附烯酮，峰27为α-香附酮。定量分析结果显示，四制前后香附烯酮含量无显著性差异，α-香附酮含量明显降低，这两种成分和炮制后产生5-HMF含量与其粉末的色度值存在显著相关性。因炮制前后成分和色度值的变化，化学计量学分析可明显区分香附和四制香附。陈皮和蒸陈皮的指纹图谱中共标示了24个特征峰。指纹图谱结果分析，蒸制对陈皮中化学成分产生了显著影响，同样产生了DDMP和5-HMF，但化学计量学分析对两者的区分存在其他因素的影响。含量测定结果显示陈皮蒸制后四种指标成分变化无明显规律，芸香柚皮苷、橙皮苷、桔皮素和DDMP与粉末的色度值存在相关性关系，可明显区分陈皮和蒸陈皮。
香附和陈皮炮制过程中存在结构转化并产生新成分，同时指标成分含量发生变化，可作为区别香附、陈皮生品与炮制品的专属特征标识和差异性特征标识。目前，许多传统饮片的炮制方法不太统一，所用辅料品种、用量及炮制工艺各不相同，药品标准中的具体操作内容也并不一致。炮制后新产生的DDMP，5-HMF具有一定的药理活性，同时也存在一定的毒性[23, 24]，控制这两成分和其他指标成分的含量，可以进一步评价炮制工艺的优劣，使饮片的炮制方法更为统一，为饮片在临床的使用提供保证。饮片粉末的色度值与这些指标成分含量存在相关性，划定其范围也可作为快速评价饮片的质量标准。
参考文献（略）