第一章 粪样处理方法对肠道菌群真实性的影响
1 材料与方法
1.1 主要试剂
表 1-1 主要试剂
采集健康昆明种小鼠（未使用抗生素类药物）新鲜粪便样本，试验组 1 的粪样直接放入无菌采样管内保存于-80℃冰箱（F组）。试验组 2 粪样快速采集至装有 10 倍量预先灭菌的PBS缓冲液（称取PBS磷酸盐缓冲液结晶 1 g，加蒸馏水定容至 1 L，pH为 7.2，121℃高压灭菌 20 min，4℃冰箱保存，pH 7.2）离心管中，快速拧紧管盖并密封，于涡旋混匀仪上剧烈摇 2~3 min（需将沉淀彻底摇匀悬浮），3500 r/min离心10 min，上清液为粪便混悬液（PF组）。试验组 3 粪样快速采集并放于装有人工胃液的采集管中（人工胃液的配制：称取 2 g NaC I、3.2 g胃蛋白酶于 1000 mL容量瓶中，加水溶解，用浓度为 1 mol/ml的稀盐酸将pH调至 1.5，过 0.2 μm滤膜，待用），将采集管迅速转移至无菌厌氧培养箱内，立即倒掉人工胃液，随后加入 10 倍量预先灭菌的PBS缓冲液（pH 7.2），于涡旋混匀仪上剧烈摇 2~3 min（需将沉淀彻底摇匀悬浮），3500 r/min离心 10 min，上清液作为粪便混悬液备用（GPF组）。3 组粪样不同处理后的样本-80℃冰箱保存，待进行高通量测序，试验中每组 3 个重复。
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2 结果与分析
2.1 微生物组数据质控评估
物种累积曲线（Speciesaccumulationcurves）表示抽样量与 OTU 数之间关系的曲线，用于衡量测序样本的数量是否足够。如图，当样本量达到 8 以后，曲线逐渐趋于平稳，此时群落中的 OTU 总数将不再增加，表明样本量已足够评估群落丰富度（图1-1）。
稀疏曲线（Rarefaction Curve）是表示测序深度与观察到物种数量关系的曲线。用于评估测序深度合理性以及显示样本间的物种丰富度差异。如图，随着测序量递增，曲线逐渐趋于平缓，即使测序数目继续增加，仅有较少的菌种数量产生，说明测序深度合理，可以进行下一步分析。同时由稀疏曲线可以看出，在相同的测序深度下，PF组与 F 组所包含的物种基本接近，GPF 组中所包含的物种量低于 F 组和 PF 组，说明粪样经过胃液-PBS 处理后，物种多样性降低（图 1-2）。
图 1-1 物种累积曲线图 图 1-2 稀疏曲线
第二章 经胃液处理的粪样微生物菌群在模拟肠道中与淡豆豉异黄酮代谢的相互作用研究
1材料与方法
1.1 药材与主要试剂
表 2-1 药材与主要试剂
采集 1 名健康志愿者的新鲜粪便（女，25 岁，三个月内没有使用任何抗生素类药物），立即放入装有人工胃液的采集管中，快速补充胃液至采集管为充满状态，盖紧瓶盖。随后将其转移至厌氧箱内，倒掉胃液。每 1 g 粪样加入 10 mL 无菌 PBS（0.1M，pH 7.2），于涡旋混匀仪上剧烈摇 2~3 min（需将沉淀彻底摇匀悬浮），3,500 r/min离心 10 min，上清液为粪便菌悬液。
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2 结果与分析
2.1 肠道菌群对淡豆豉异黄酮类成分的代谢转化
2.1.1 方法学考察
2.1.1.1 质控样本评价
所有对照品等量混合制备成为 QC 样本，采用 QC 样本对检测过程稳定性进行考察，各待测物 RSD%<10%，说明实验数据稳定可靠（表 2-3）。
表 2-3 QC 样本对照品的保留时间及峰面积的 RSD 值
表 2-4 6 种异黄酮类成分的线性关系
讨论
1 粪样处理方法对肠道菌群真实性的研究
体外全模拟肠道系统是在体外重现体内胃肠微生态环境一种模型，以粪便样本作为菌源，尽可能地模拟体内的温度及厌氧条件，多用于药物胃肠代谢研究[24,25]。新鲜粪便作为体外全模拟肠道系统的菌群来源，采集过程中会受到空气杂菌的污染，对模拟系统中的菌群形成一定的干扰，恰当的处理能够保证模拟体系粪样接种微生物组样本的真实性。由于胃肠环境中菌群大多来自食物，经历胃、肠，通过粪便排出体外[18]，所以本研究在通常用 PBS 对粪样处理的基础上，用胃液对接种微生物进行处理。结果显示胃液能显著降低粪样菌群的多样性，使菌群结构发生显著变化。胃液能显著增加粪杆菌属（Faecalibacterium）、乳梭菌属（Clostridium）、布劳特氏菌属（Blautia）、嗜冷成对杆菌（Dyadobacter）、罗氏菌属（Roseburia）、Ambiguous_taxa、黄杆菌属（Flavonifractor）、萨特氏菌属（Sutterella）、Candidatus_Solibacter、梅毒螺旋体_2菌属（Treponema_2）、韦荣球菌科 UCG_003 菌属（Erysipelotrichaceae_UCG_003）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）的相对丰度，同时能降低嗜冷菌属（Algoriphagus）的相对丰度。其中粪杆菌属（Faecalibacterium）来自于厚壁菌门，为肠道中与短链脂肪酸产生相关的有益菌[26]。乳梭菌属（Clostridium）来自厚壁菌门，在肠道中多数为非致病菌，少数为致病菌[27]。布劳特氏菌属（Blautia）来自厚壁菌门，是具有益生菌特性的厌氧菌之一，广泛存在于哺乳动物的粪便和肠道中[28]。罗氏菌属（Roseburia）来自于厚壁菌门，为肠道中产生丁酸的优势菌[29]。而胃液抑制的嗜冷菌属最适生长温度为-15~20°C，并非为胃肠道菌群[30]。胃液处理能显著增加肠道中的优势菌属，降低并非为肠道菌的嗜冷菌属的相对丰度，对粪样菌群起到了筛选作用，能有效的还原肠道菌群的真实性。
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结论
胃液能显著降低粪样菌群微生物的多样性和改变菌群结构，因此在通常 PBS 处理的基础上采用胃液-PBS 对粪样的处理能有效的还原肠道菌群的真实性。在粪样经胃液-PBS 处理后接种的体外全模拟肠道中，肠道菌群能进一步转化淡豆豉经炮制微生物转化后少量存在的糖苷型异黄酮，同时对相对含量较高的苷元型异黄酮有较强的代谢转化作用；淡豆豉代谢同时对肠道菌群结构有显著的调控功能，显著上调多种有益菌属并下调某些条件致病菌属的相对丰度。
参考文献（略）