本研究通过脂多糖处理巨噬细胞构建炎症模型，通过雷公藤甲素治疗后炎症因子 IL-1β、IL-10 和 TNF-α的表达和分泌减少。虽然我们只测定了雷公藤甲素对这些炎症介质的影响，也可能对其他炎症介质起作用，这还有待进一步研究。同时，雷公藤甲素处理 RAW264.7 抑制细胞 HMGB1、RAGE 和 NF-κB 的 mRNA 水平及蛋白表达，推测雷公藤甲素对炎症的抑制作用可能与通路 HMGB1/RAGE/NF-κB 相关。HMGB1 / RAGE /NF-κB 信号通路的阻断可能代表了一种新型的炎症治疗策略，为此，雷公藤甲素影响 HMGB1 / RAGE /NF-κB 信号通路的详细作用机制还有待进一步阐明。
第 1 章 前言
巨噬细胞作为固有免疫的重要组成成分，能保护机体免受外来病原菌的入侵，并通过释放抗炎和促炎细胞因子积极支持免疫应答[1]。巨噬细胞是单核吞噬细胞的一个组分，对维持免疫稳态至关重要，它们在炎症免疫反应的启动和调节中起重要作用。巨噬细胞的基本作用是产生主要的促炎细胞因子和炎症介质激发机体炎症响应，同时通过产生抗炎细胞因子和摄取病原体来化解炎症。具有不同功能的巨噬细胞亚群包括经典激活或炎症（M1）和交替激活或抗炎（M2）巨噬细胞。M1 巨噬细胞通常由 Th1 细胞因子(如 IFN-γ和 TNF-α)或细菌脂多糖(LPS)识别诱导。这些巨噬细胞产生和分泌较高水平的促炎细胞因子 TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和环氧合酶-2(COX-2)，而 IL-10 水平较低。M2 巨噬细胞通过 IL-4 受体α (IL-4Rα)激活 STAT6，被 Th2 细胞因子 IL-4 和 IL-13 极化，具有抗炎作用。除 IL-4 和 IL-13外，IL-10 等细胞因子还可通过 IL-10 受体（IL-10 R）激活 STAT 3 来调控 M2 极化。这些炎症因子对于炎症的平衡和恢复有着重要作用。
具有抗炎活性的天然产物与人类健康密切相关，在预防和治疗炎症中发挥了重要作用。目前，开发和研究具有抗炎活性的天然产物具有重要意义。雷公藤甲素（Triptolide，TP）是从卫矛科植物雷公藤的根、叶、花和果实中提取的一种环氧二萜内酯类化合物[2,3]。药理及临床研究证实，雷公藤甲素具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤和免疫抑制等多种药理作用[4]。对于肿瘤性疾病，如肺癌胰腺癌等有较好的治疗效果，同时对于炎症性疾病，如类风湿性关节炎、肾炎、系统性红斑狼疮等都有较好的治疗效果[5]。雷公藤甲素参与多种途径直接诱导乳腺癌细胞凋亡和自噬[6]，包括抗雌激素受体（ER）活性、阻滞丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路、诱导 p53 依赖、溶酶体介导的信号通路以及抑制 Wnt/β-catenin 通路等。雷公藤甲素选择性地抑制 M2 巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的功能，并对 TAM 细胞的活力、分化和细胞因子的产生具有抑制作用[7]。
高迁移率族蛋白-1（HMGB1）属于 HMGB 蛋白家族，由两个 DNA 结合域和一个带负电荷的 C 末端组成，是一种炎症相关蛋白[8]。晚期糖基化终产物 RAGE，作为 HMGB1 的主要受体，同时也是炎症和细胞因子产生的促进剂[9]，在包括巨噬细胞在内的许多细胞类型中被发现，其参与细胞自噬和凋亡过程。NF-κB 通路对炎症因子等多种免疫刺激信号会有一定的反应，如 IL-1，TNF-α、病原体相关分子模式(PAMP)等。NF-κB 是炎症激活的重要调节剂。HMGB1 激活晚期糖基化终产物（RAGE）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、toll 样受体（TLRs）、核因子-κB（NF-κB）、Src 家族激酶信号通路等，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。HMGB1 及其下游受体 RAGE、TLRs、趋化因子受体 4（CXCR4）等均是抗肿瘤、抗炎的重要靶点[10]。有报道称雷公藤甲素可通过抑制 HMGB1/NF-κB/TLR4 信号通路来抑制 MCF-7、MDA-MB-231 乳腺癌细胞的生长[11]。但雷公藤甲素在巨噬细胞抗炎方面还未有大量报道，同时雷公藤甲素作用于 HMGB1 / RAGE /NF-κB 通路的抗炎机制目前仍不明确。
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第 2 章 材料与方法
2.1 实验材料
本实验所用小鼠腹腔巨噬细胞 RAW264.7，购买自美国 ATCC 细胞库；药品与试剂：
表 1 药品与试剂
2.2 实验方法
2.2.1 RAW264.7 细胞培养（细胞复苏，细胞传代及细胞冻存)
准备工作：细胞房定期做好灭菌清洁等工作，每隔两周进行一次彻底的清扫灭菌消毒，标准为保证室内无肉眼可见垃圾（碎纸屑，废旧试剂瓶等），然后使用 75%酒精擦拭地板、细胞培养箱表面等设施，打开紫外灯，过夜照射。细胞培养过程中所使用的耗材（枪头、离心管、冻存管等）进行高压蒸汽 121℃灭菌 30 min，干燥箱风干（160℃，2h）,备用。细胞培养用的胎牛血清（FBS）在使用之前先从-20℃转入 4℃过夜，0.22μm 过滤膜进行过滤。细胞实验操作前，所有耗材和试剂都首先进行 75%酒精的消毒，耗材在超净台进行紫外照射 30 分钟。小鼠腹腔巨噬细胞：RAW264.7，于 DMEM 高糖培养基（含 1%青霉素-链霉素， 10% FBS）正常培养。
细胞复苏: 75%酒精消毒超净台，紫外照射，同时将水浴锅升温至 37℃。从液氮罐中取出冻存细胞，置于水浴锅中，保证在一分钟内充分溶化，75%酒精擦拭管壁后在超净台内将细胞悬液转入含 5 倍体积以上的 DMEM 完全培养基的 15mL 离心管中，1000 rpm 离心 5 min 后,弃掉上清，加入 2mL 培养液后，轻轻吹打并重悬细胞并使用血球计数板进行计数;将细胞悬液转入 25cm2培养瓶中，在超净工作台桌面轻轻水平十字振荡后静置，在显微镜下观察细胞密度是否均匀，放入 37℃、5% CO2细胞培养箱中培养过夜。次日根据显微镜下观察的细胞贴壁情况、细胞数量及状态决定是否换液，若细胞贴壁良好，进行换液处理。
表 2 实验仪器
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第 3章 结果..................................16
3.1 LPS 不同浓度及时间对 RAW264.7细胞 TNF-α表达的影响...........................16
3.2 不同浓度 TP 对 RAW264.7细胞存活率的影响................................16
3.3 LPS 刺激后 TP 对 RAW264.7细胞中 HMGB1﹣RAGE﹣NF-κB 信号通路蛋白表达及下游炎症因子表达水平影响.........17
第 4章 讨论............................25
第 5章 结论与展望...........................28
第 4章 讨论
LPS 是刺激机体引起天然免疫的重要因子,环境中普遍存在于细菌细胞膜成分中。其又称内毒素，可以诱导包括促进炎症在内的多种功能反应，并上调约 100 种不同的基因，包括编码促炎症细胞因子、信号分子和转录调节因子的相关基因。过度暴露于 LPS 导致高发病率是重症监护病房最常见的死亡原因[12]。有大量研究表明，LPS 作用于巨噬细胞后会刺激机体产生炎症反应，引起相应验证通路的变化以及炎症下游炎症因子的改变。细胞外 LPS 可被天然免疫细胞表达的种系编码模式识别受体中的 TLR4 特异性识别，激活 MyD88 依赖的信号通路。随后，下游核因子NF-κB 基因结合有丝分裂活化蛋白激酶（MAPK）信号通路被激活，进而促进 IL-1β，IL-10，TNF-α等炎症因子和粘附分子和集落刺激因子的表达，从而引发一系列炎症[13]。导致炎症的主要原因有物理性因子、坏死组织和免疫反应等[14]。炎症通常会被编码模式识别受体（PRR）识别[15]，PRRs 有助于细胞刺激，从而触发炎症基因的转录和下游细胞因子及趋化因子的释放。当局部巨噬细胞及中性粒细胞被大量激活释放时，有些细胞因子就会产生内分泌效应；这些促炎细胞因子激活内皮细胞，导致血管通透性增加并促进免疫细胞进入该感染部位或组织，造成急性期诱导症状[16,17]。另一方面，与中性粒细胞相比，单核细胞迁移到组织中的时间稍晚，巨噬细胞作为吞噬细胞和细胞因子的产生者[18,19]。发生在巨噬细胞中的炎症反应以炎性介质的过度产生为特征，包括细胞因子 IL-1β、IL-10 和 TNF-α。因此，对于以炎症为特征的疾病来说，调节炎性介质的产生是一种有效的治疗策略[20]。IL-1β和 TNF-α是激活免疫炎性细胞重要的促炎细胞因子，而 IL-10 具有抑制炎症的作用。它们是具有良好特征的炎症介质，参与炎症反应的启动和放大。本研究选取 IL-1β，IL-10，TNF-α作为巨噬细胞炎症反应的生物标志物，这些炎症介质的释放和表达与炎性疾病的发病率和死亡率之间存在着很强的相关性[21]。
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第 5 章 结论与展望
我们根据查阅文献设计实验分组，摸索实验条件，利用分子生物学实验ELISA、WB 和 RT-PCR, 分别从炎症因子分泌水平、蛋白和基因表达水平探索了雷公藤甲素可以经由通路 HMGB1/RAGE/NF-κB 在细胞内起到抗炎作用，具体表现在雷公藤甲素可以经由通路 HMGB1 / RAGE /NF-κB 降低下游炎症因子 IL-1β、IL-10和 TNF-α的表达。从 WB 实验结果分析来看，雷公藤甲素明显抑制了通路中蛋白HMGB1、RAGE 和 NF-κB 的表达；以及荧光定量 PCR 结果显示，雷公藤甲素显著降低了蛋白 HMGB1，RAGE，NF-κB 的基因的表达。所以，雷公藤甲素可以在细胞内通过抑制 HMGB1 / RAGE / NF-κB 通路起到抗炎作用。
本研究通过脂多糖处理巨噬细胞构建炎症模型，通过雷公藤甲素治疗后炎症因子 IL-1β、IL-10 和 TNF-α的表达和分泌减少。虽然我们只测定了雷公藤甲素对这些炎症介质的影响，也可能对其他炎症介质起作用，这还有待进一步研究。同时，雷公藤甲素处理 RAW264.7 抑制细胞 HMGB1、RAGE 和 NF-κB 的 mRNA 水平及蛋白表达，推测雷公藤甲素对炎症的抑制作用可能与通路 HMGB1/RAGE/NF-κB 相关。HMGB1 / RAGE /NF-κB 信号通路的阻断可能代表了一种新型的炎症治疗策略，为此，雷公藤甲素影响 HMGB1 / RAGE /NF-κB 信号通路的详细作用机制还有待进一步阐明。
参考文献（略）