第一章 平卧菊三七提取物药效评价及有效部位筛选
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
材料与试剂
2 实验方法
2.1 药材
平卧菊三七于 2017 年 8 月采自江西省靖安县，经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为平卧菊三七 Gynura procumbens (Lour.) Merr 全草。存于江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。
2.2 实验动物
健康 Wistar 大鼠，雄性，SPF 级，体重 180±20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK（京）2016-0006，自由饮水饮食，温度湿度适宜，昼夜 12 h 交替，于 SPF 级环境下适应性喂养一周。
2.3 大鼠 AKI 模型建立
大鼠造模前称取体重，禁水 24 h，再次称取禁水后体重，以保证动物处于脱水状态，除空白组外其余各组分别按 10mL/kg 给药体积份数分别在大鼠两后肢内侧肌肉注射 50%甘油溶液造模，注射 1 次，造模后恢复饮水[51]，48 h 后，确认造模成功；每隔两天，异氟烷气体麻醉，用毛细管在眼眶静脉丛收集血样，4℃冰箱静置 2 h，低温高速离心机离心（4 °C，4000 rpm，15 min）以获得血清样本，使用日立 7100 全自动生化分析仪检测肾功能 BUN、CRE 指标，从而判断急性肾损伤模型是否建立成功。
2.4 乙醇提取物和水提取物组的实验药物制备与配制
2.4.1 乙醇提取物、水提取物制备
取平卧菊三七茎叶药材 2.2 Kg，粉碎，用 10 倍量 80%乙醇提取 2 次，每次2 h，合并提取液，滤过，减压浓缩至无醇味，得粗浸膏 367.4 g。取平卧菊三七茎叶药材 2.2 Kg，粉碎，用 10 倍量水提取 2 次，每次 2 h，合并提取液，滤过，减压浓缩，得水提取物粗浸膏 411.4g。
2.4.2 实验药物的配制
平卧菊三七乙醇提取物、水提取物，临用前用 0.9% 生理盐水溶液配制成适宜浓度的母液备用。地塞米松（0.75mg/片，安徽金太阳生化药业有限公司，国药准字 H34021845），临用前研磨成粉末用 0.5% CMC-Na 溶液配制成 0.5 mg/mL混悬液。
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第二章 有效部位成分分析及有效成分体内外药效研究
1 材料与仪器
1.1 仪器
平卧菊三七乙醇提取物不同萃取部位药效筛选实验结果表明乙酸乙酯部位为最佳药效部位；进而结合液质联用技术对乙酸乙酯部位有效成分进行分析推测，对推测的有效成分采用 LPS 诱导的足细胞进行体外药效实验，同时采用甘油诱导的急性肾损伤大鼠进行体内药效实验验证，筛选出发挥药效的最佳有效成分。
平卧菊三七是一种药食同源的植物，它常用于治疗多种疾病，如炎症、癌症、糖尿病、高血压、高脂血症等[53-59]。目前，研究发现其主要含有黄酮类、酚酸类、萜类等[21]。因此本研究首先应用液质联用技术推测其相关药效成分并运用 HPLC法对乙酸乙酯部位有效成分进行含量测定，其次通过比较不同有效成分对大鼠血清中 BUN、CRE 水平，肾脏指数以及肾脏组织结构的影响，筛选乙酸乙酯部位的最佳药效成分。
仪器
2 实验方法
2.1 平卧菊三七醇提物的乙酸乙酯部位的成分分析
2.1.1 液相条件
采用 Welch Ultimate UHPLC XB-C18色谱柱（2.1×100 mm,1.8 μm），流动相乙腈（B）-0.1% 甲酸水（A）梯度洗脱：0-3 min，2%-10% B；3-12 min，10%-17.5% B；12-20 min，17.5%-18% B；20-27 min，18%-30% B；27-34 min，30%-60% B；34-39 min，60%-95% B；39-42 min，95% B；42-42.01 min，95%-2% B；流速：0.3 mL·min−1；柱温：45 ℃；进样量：3 µL。
2.1.2 质谱条件
采用 ESI 离子源，在负离子模式下采集数据：喷雾电压-4500 V，离子源温度（TEM）500 ℃，气帘气（CUR N2）25 psi，雾化器(GSI N2)和辅助器(GS2 N2)均为 50 psi，质量扫描范围为 m/z：50-1250，去簇电压（DP）-100eV，碰撞电压（CE）-30 eV，碰撞电压差（CES）10 eV，开启动态背景扣除。
2.1.3 数据处理
根据前期研究设定的液相与质谱条件，对平卧菊三七乙酸乙酯部位进行 UHPLC-QTOF-MS/MS 分析。将数据导入 Peakview，利用提取离子色谱（XIC）完成平卧菊三七乙酸乙酯部位主要化学成分筛选，其中主要为以绿原酸类为主酚酸类化合物。图 2-1 为平卧菊三七乙酸乙酯部位 UHPLC-QTOF-MS/MS 总离子流图，图 2-2 为液相图。
图 2-1 乙酸乙酯部位总离子流图
第三章 基于血浆代谢组学研究 4，5-二咖啡酰奎宁酸对大鼠急性肾损伤的作用机制 . 39
1材料与仪器 .................................... 39
1.1 仪器 .............................................. 39
1.2 试剂和材料 ...................................... 40
1.3 动物 .......................... 40
总结 ................................. 51
3. 实验结果
3.1 大鼠急性肾损伤模型代谢轮廓分析
在正离子和负离子模式下，质控样品中 10 个典型的离子峰的峰强度和保留时间显示出高度的重叠。PCA 图中 QC 样本的高度聚类（图 3-1）；数据质量符合统计分析要求，证实了方法的重现性。血浆代谢物在 ESI-和 ESI+下的信号响应。结合电喷雾化−模式对其分布进行分析。通过 SIMCA-P 多元统计软件分析处理代谢组学数据集。如图 3-1 所示，可以清楚地看到两组血浆样品在 PCA 图中的聚类分离，实验结果表明在分析的血浆样品中，ESI 正离子模式和负离子模式下，正常组和模型组的代谢轮廓存在显著差异。AKI 大鼠的代谢水平与正常大鼠有明显区别。OPLS-DA 分析是用于两组样本间有监督模式下的多元分析，两组样本明显于左右两侧分列，说明了两组样本间代谢产物存在本质不同。
建立准确的判别模型对从大量的代谢组学数据集中筛选出潜在的差异代谢物具有重要意义。为了验证模型的预测准确性，进行了 200 次随机置换测试（PRT），结果表明，在正负两种离子模式下，模型的拟合优度和预测能力（R2/Q2）均高于任何置换模型。因此，OPLS-DA 模型具有较高的可靠性和预测能力。
图 3-1. 大鼠 AKI 模型代谢轮廓分析（A. ESI-， PCA 分析； B. ESI+，PCA 分析； C. ESI-， OPLS-DA 分析； D. ESI+， OPLS-DA 分析）
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总结
本论文建立大鼠 AKI 模型，从肾脏组织切片观察及生化指标方面研究平卧菊三七乙醇提取物及水提物药效，以及乙醇提取物不同极性部位对大鼠急性肾损伤的治疗效果，为后续进一步研究其有效成分奠定基础。
不同提取物的药效结果表明，乙醇提取物效果最佳，因此对乙醇提取物的不同萃取部位进行了药效筛选，得出乙酸乙酯萃取部位为最佳药效部位；进而结合液质联用技术对乙酸乙酯部位的有效成分进行成分推测和有效成分 HPLC 法含量测定，并对有效成分对 LPS 诱导的足细胞开展体外药效评价，同时采用甘油诱导的急性肾损伤大鼠进行体内药效实验验证，筛选出发挥药效的主要有效成分为 4,5-二咖啡酰奎宁酸。
进一步选用 4,5-二咖啡酰奎宁酸对甘油诱导的 AKI 模型大鼠进行药效机制研究，并利用 UHPLC-QTOF-MS/MS 技术进行血浆代谢组学研究。通过对大鼠AKI 模型的代谢轮廓进行分析，鉴定出与 AKI 模型大鼠相关的 53 个主要生物标志物，分别为氨基酸类、脂肪酸类、甘油磷脂类、柠檬酸类和其他类，主要与丙酮酸代谢、柠檬酸循环(TCA 循环)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、酮体的合成与降解、β-丙氨酸代谢氨酰-tRNA生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、酪氨酸代谢乙醛酸和二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢、丁酸代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路相关。血浆代谢组学结果表明，4,5-二咖啡酰奎宁酸对其中 6 个生物标志物（3-methylhistidine, guanidoacetate, phosphatidylcholine O-38:1, phosphatidylethanolamine O-42:3, 3-indoxyl Sulfate, Malic acid）具有显著调控作用，主要涉及到丙酮酸代谢、柠檬酸循环(TCA 循环)、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代谢等代谢通路。
参考文献（略）