本文是一篇医学论文，本实验结果初步验证了前期芯片检测结果及实验假说，为课题组深入阐明SR-B1通过ERK影响HIF-2α促肾透明细胞癌细胞增殖的分子机制奠定基础。
第2章材料与方法
2.1材料
2.1.1实验细胞株
医学论文参考
2.1.2构建质粒
构建SR-B1过表达及沉默实验质粒，质粒由吉凯或吉玛公司制备。
2.1.3实验所用抑制剂及激动剂
ERK抑制剂（SCH772984）购自于Sellect公司、ERK激动剂（EGF）购自于Peprotech公司。
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2.2实验方法
2.2.1细胞培养
2.2.1.1细胞复苏
1.做准备工作，首先将37℃恒温箱打开，使水温升至37℃，使用已配好的75%的酒精棉擦拭超净台后，将细胞复苏所需实验用品包括手套、移液枪、枪头、垃圾桶等放置超净台中紫外线消毒30分钟。
2.将细胞复苏实验所需培养基、血清、双抗、胰酶及PBS从4℃冰箱拿出放置常温，使其温度恢复至室温。
3.紫外线消毒结束后，打开日光灯，戴好无菌手套。用75%的酒精喷涂双手后进入超净台，取酒精棉球擦拭超净台台面2遍，再用75%酒精棉擦拭从移液枪枪头向枪尾擦拭至少2遍（注意擦过移液器的酒精棉不能反复使用）。等待手上的酒精完全蒸发后用打火机点燃酒精灯，按顺序摆好物品准备后续实验。将超净台外的试剂用75%酒精消毒后，放入超净台中，打开封口膜，再用75%酒精棉擦拭从瓶口向瓶尾擦拭至少2遍，一切准备完毕后开始实验。
4.配置完全培养基：原培养基：胎牛血清为9：1的比例，加1%的双抗混匀。选取15mL的离心管，向内注入3mL配置的完全培养基。再选取25cm2或者75cm2培养瓶，向内注入3mL或者9mL配置的完全培养基（注意所有打开的离心管盖或培养瓶盖再过火，将管盖或瓶盖放在靠近酒精灯的位置保证其不被污染，将管子放在离心管架上，管口靠近看酒精灯）。
5.从液氮罐或者-80℃冰箱将细胞取出，37℃水中放置1min，转圈解冻至快要融化后喷洒酒精至管壁置入超净台。
6.超净台内酒精棉擦拭冻存管，待酒精蒸发后，打开用1mL的枪将细胞完全吸出并放入15mL离心管中，吹打混匀，同时标记细胞名称及细胞代数，800rpm，离心5min。
7.离心后弃上清、留沉淀、吸弃残余液体。后加入1mL完全培养基重悬细胞，吹打混匀后放入盛有3-4/9-10mL含有细胞培养基加入25cm2或者75cm2培养瓶中，将细胞“8字”铺匀，置于与37℃恒温细胞培养箱中；
8.24h后用显微镜观察细胞的生长情况，根据情况进行后续实验。
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第3章结果
3.1肾透明细胞癌细胞中SR-B1、ERK及HIF-2α蛋白表达呈正相关，且三者可相互结合
3.1.1肾透明细胞癌细胞中SR-B1、ERK与HIF-2α表达呈正相关
为了验证假说，我们首先探讨SR-B1、ERK及HIF信号通路关键蛋白HIF-2α三者是否可以在肾透明细胞癌中发挥共同或级联作用，我们应用基因表达谱数据库动态分析（http://gepia2.cancer-pku.cn/）对SR-B1、ERK及HIF-2α三者之间的相关性进行初步检测，检测结果显示SR-B1与ERK（R=0.24，P=3.2e-0.8（)图1 A），SR-B1与HIF-2α（R=0.31，P=6e-15)（图1 B），及ERK与HIF-2α（R=0.73，P=0）（图1 C）三组蛋白之间存在相关性。此外，在蛋白水平上对其进行了进一步检测。将生长状况良好的HK-2、786-0及Caki细胞三株细胞系分别铺至三个培养皿中，待细胞长满培养皿后对其蛋白进行提取，期间除换液外不做任何处理，随后对其进行蛋白检测。实验结果显示SR-B1、ERK、p-ERK及HIF-2α均在786-0及Caki细胞中高表达，在HK-2细胞中低表达（P<0.001或P<0.01）（图1D-E），肾透明细胞癌中SR-B1、ERK与HIF-2α的蛋白表达呈正相关。
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3.2透明细胞肾细胞癌中HIF通路关键分子HIF-2α高表达，其高表达的肾透明细胞癌患者生存预后相对较差
3.2.1生物信息学预测显示透明细胞肾细胞癌中HIF-2α高表达
为了探究HIF通路关键分子HIF-2α（EPAS1）在肾透明细胞癌中发挥的作用，我们初步观察了HIF-2α在肾透明细胞癌组织和正常肾组织中的表达分布情况。首先应用基因表达谱动态分析数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/）初步预测该数据库中现有的523例肾透明细胞癌组织样本及100例正常肾组织样本中HIF-2α的表达，经数据整合分析发现，与肾正常组织样本相比，肾透明细胞癌组织样本中的HIF-2α显著高表达（T=523，N=100)（P<0.05）（图3 A）。其次，使用UALCAN在线分析数据网站（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）评估HIF-2α在肾透明细胞癌中的临床病理意义。数据结果提示HIF-2α表达与患者性别、年龄、肿瘤分级及淋巴结转移状况密切相关。其中女性肾透明细胞癌患者HIF-2α阳性表达率显著高于男性肾透明细胞癌患者（P=2.749600E-02）（图3 B），HIF2α高表达的肾透明细胞癌患者患病年龄21-100岁不等，且在41-60岁年龄段的患者明显多于其他年龄层（P=1.132130E-02）（图3 C），而从HIF-2α在肾透明细胞癌分级中的表达情况来看，HIF-2α高表达的肾透明细胞癌患者的肿瘤分化较差（Grade 3-4），肿瘤细胞异型性高，肿瘤组织与正常肾组织差别大（P=3.856400E-01），恶性程度高，易发生淋巴结转移（P=8.720800E-01）（图3 D），相反，HIF-2α低表达的肾透明细胞癌患者肿瘤的分化程度较高（Grade 1-2），癌组织细胞分化与正常组织细胞分化差异较小（P=1.777060E-04），恶性程度较低，淋巴结不易发生转移（P=1.43919987038998E-10）（图3 E）。总体生存率方面，数据库采用Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验对其进行分析，结果显示HIF-2α低表达组肾透明细胞癌患者的生存预后较好，HIF-2α高表达组肾透明细胞癌的患者生存预后较差（P<0.0001）（图3 F）。
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第3章结果......................................17
3.1肾透明细胞癌细胞中SR-B1、ERK及HIF-2α蛋白表达呈正相关，且三者可相互结合.............................17
3.1.1肾透明细胞癌细胞中SR-B1、ERK与HIF-2α表达呈正相关....................17
3.1.2肾透明细胞癌细胞中SR-B1、ERK与HIF-2α之间存在蛋白互作............18
第4章讨论..............................34
4.1肾透明细胞癌、脂质代谢与SR-B1...................................34
4.2肾透明细胞癌与HIF信号通路........................................35
4.3透明细胞肾细胞癌与ERK/MAPK通路..............................36
第5章结论............................40
第4章讨论
4.1肾透明细胞癌、脂质代谢与SR-B1
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)占全身恶性肿瘤的3%，约占成人肾脏肿瘤病例的95%[1]。RCC在组织学上分为三种亚型，其中透明细胞肾细胞癌是最常见的肾癌亚型，发病率高，占RCC的80%以上，死亡率持续增加，易转移、预后差、化疗易产生耐药及复发率高是其主要临床特点[2-4]，组织学特点为胞浆中含有丰富的糖原和脂质[5]。
目前，越来越多的证据表明包括ccR CC在内的肾细胞癌是一种代谢性疾病，且ccR CC的发生发展通常被认为与脂质代谢息息相关[6]。研究表明，ccR CC细胞中胆固醇、胆固醇酯和中性脂质（甘油三酯）的含量远高于普通组织[7]。与其他癌症相比，ccR CC脂质代谢的差异问题尤为明显。作为ccR CC最显著的病理特征，脂滴堆积的存在不仅揭示了ccR CC的脂质代谢异常，也预示着ccR CC细胞的一些死亡途径[27]。且最近有文献表明，肾透明细胞癌中也存在脂质受体基因的转录升高[31]。B类1型清道夫受体作为HDL胆固醇脂质载体被广泛研究[9]。SR-B1作为膜载体可以承载HDL胆固醇酯的选择性摄取或吸收的载体进入细胞和组织[28]，导致组织和细胞胆固醇脂积累诱发人体疾病。作为质膜胆固醇含量的调节剂促进脂溶性维生素的吸收以及病毒进入宿主细胞，影响人类体内程序性细胞死亡的发生发展、女性生育能力的减弱、血小板功能的失调、脉管系统炎症以及饮食引起的动脉粥样硬化和心肌梗塞的产生及加重[29,30]。SR-B1作为一种致癌基因，在多种肿瘤细胞中高表达，如乳腺癌[32]、前列腺癌[33，34]。Sundelin JP[35]等人对356个RCC进行免疫化学分析发现：肾透明细胞癌中SR-B1较正常肾脏组织相比表达增高，同时SR-B1活性越高促进肾透明细胞癌对脂蛋白的摄取量越大，肿瘤细胞恶化速度加剧，肿瘤细胞生长增快，最终导致ccR CC发生发展[29]。且文献研究表明，SR-B1高表达的患者预后较正常表达患者预后差，生存期更短[30]。令人欣慰的是，本课题组前期得到的实验结果与文献报道相似。由此可见，SR-B1在ccR CC中作用非常突出，值得进一步探讨。
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第5章结论
1.SR-B1可通过调节ERK表达调控HIF-2α及VEGF的转录表达；
2.SR-B1可通过ERK调控HIF-2α表达促肾透明细胞癌细胞的增殖。
参考文献（略）