本文是一篇医学论文，本研究意外地发现了LADS作为细菌抗原载体呈递细菌抗原时，LADS作为载体就能发挥优异的抗菌感染的能力，LADS作为首个非截短形式的减毒李斯特菌疫苗载体，在抗菌感染方面展现了保护免疫的潜力。
第一章 减毒单增李斯特菌的免疫原性
1. 材料与方法
1.1菌株及培养方法
本章试验涉及到的菌株均保存在本实验室：减毒重组以及缺失单增李斯特菌LADS和LAPD以及野生李斯特菌株EGD-e和10403S。用于细菌培养的培养基为BHI培养基，若无特殊说明，本章涉及菌种培养条件均为37℃振荡培养。
1.2试剂及仪器
本试验所用仪器和试剂见表1.1（相同试剂和仪器不在重复出现）。
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2. 试验结果
2.1减毒李斯特菌毒力
为了确定LAPD的毒力，分别以不同浓度的减毒李斯特菌LAPD通过腹腔注射感染ICR小鼠，最高浓度为109 CFU/只，最低浓度为106 CFU/只。结果如图1.1（A）所示，减毒李斯特菌LAPD的LD50是109.19 CFU，毒力比野生菌EGD-e显著降低（8709倍），与LADS的毒力相差无几。因此，LAPD的毒力显著减弱。
2.2 LAPD脏器清除
脏器清除为了进一步确定LAPD的安全性，以安全剂量108 CFU/只（0.1×LD50）对ICR小鼠感染，每组五只小鼠，每24 h解剖一组，一周后琼脂平板上无菌落长出。结果如图1.1（B）所示，在感染七天后小鼠脾脏和肝脏中存在的细菌均将降到100 CFU以下。说明LAPD感染小鼠后，小鼠体内的细菌可在一周代谢清除。
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第二章 基于LADS为载体抗嗜水气单胞菌感染疫苗的构建
1. 材料与方法
1.1 菌株及培养条件
本章试验所涉及的菌株均保存在本实验室，主要有：减毒单增李斯特菌LADS、大肠杆菌E.coli DH5α、大肠杆菌E.coli Rosetta。
本章所用大肠杆菌和李斯特菌所用培养基分别为LB培养基和BHI培养基。以上菌株培养条件均为37℃，200 r振荡培养（也可静置）。
1.2试剂配制
(1) LB液体培养基：称取5 g Yeast Extract、2.5 g TryPtone和5 g NaCl，溶解于500 mL ddH2O，高压灭菌后在常温条件下储存。
(2) 50×TAE溶液：使用天平称取242 g Tris Base，量筒量取57.1 mL冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），定容至1 L。
(3) 1%琼脂糖凝胶：在微波炉加热的条件下，将1 g Agarose H完全溶解在100 mL 0.5×TAE溶液，加入10 µL GoldViewⅡ Nuclear Staining Dyes，混合均匀后使用。 (4) TZ buffer：称取1 g NaN3，量取8 mL Triton X-100，溶解于Tris-HCl，pH调至8.0，定容至200 mL。
(5) 75 mmol/L的CaCl2溶液（含15%甘油）：称取1.1027 g的CaCl2·2H2O溶于85 mL ddH2O，在加入15 mL甘油。
(6) SRBC-0.9% NaCl：取绵羊血红细胞离心10 min，离心条件：1000 r，4℃；弃上清，加入生理盐水重悬（动作尽量温柔以免破坏红细胞）清洗，在1000 r，4℃条件下离心10 min，看情况清洗2-3次（除白细胞和血清），按照1:20的比例将生理盐水和洗好的红细胞混合，即为SRBC-0.9% NaCl。
(7) 李斯特裂解液（listerialys）：量取2% TritonX-100 2 mL，1 g SDS，0.5844 g NaC l，0.12114 g Tris-HCl，0.09224 g EDTA，ddH2O溶解并定容至100 mL。
(8) 4×Protein laoding：称取6 g Tris-base、0.8 g溴酚蓝和16 g SDS，80 mL甘油混合在一起，ddH2O定容至200 mL，37℃恒温保存。
(9) 4×Separation gel buffer：称取118.2 g Tris-HCl，在ddH2O中溶解，将其pH调整至8.8，体积定容到500 mL。
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2. 试验结果
2.1 pSL1890重组质粒的构建
根据图2.1的构建策略，使用减毒李斯特菌LADS全基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增含酶切位点Eco R I的片段A（498 bp）和含酶切位点BamH I的片段C（500 bp），同样利用PCR以嗜水气单胞菌全基因组DNA为模板，扩增目的基因OmpW基因的片段B（552 bp）。在此基础上，通过重叠PCR技术（SOE-PCR）将三个片段连在一起获得“A-B-C”（pSL1890）的目的片段。以EcoR I和BamH I为酶切位点，通过酶切酶联将目的片段克隆至李斯特菌穿梭质粒pKSV7，获得同源重组质粒pSL1890。
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第三章 基于LADS为载体抗嗜水气单胞菌感染疫苗免疫保护评价 .................... 35
1 材料与方法 ........................................... 35
1.1 菌株及培养条件................................. 35
1.2 试剂及仪器.............................. 35
第四章 LAPD-E7的构建及免疫治疗效果评价 ............................ 41
1 材料与方法 .............................. 41
1.1 菌株及培养条件......................... 41
1.2 宫颈癌细胞系及培养条件....................... 41
第四章 LAPD-E7的构建及免疫治疗效果评价
2. 试验结果
2.1 LAPD-E7成功构建
将质粒库里保存的重组质粒电转pSL3340进LAPD的感受态内，挑取阳性菌落在42℃的条件下连续传代（培养基中含cm抗性），每传五代进行菌液划线取单菌落验证，选大条带（即为同源重组成功）的菌落接种于液体培养基（不含抗性），在30℃的温度条件下连续传代培养以丢掉同源重组后的质粒，每传五代取菌液划线挑取单菌落进行抗性筛选取无抗性克隆（已成功丢掉质粒），在通过PCR进行二次验证，选取PCR阳性的进行基因测序，均验证正确即得到LAPD-E7。
2.2 LAPD-E7体外生长能力和溶血活性分析
为了探究外源基因E7的加入是否会影响LAPD的体外生长能力以及是否会对LAPD的安全性有所影响，对LAPD-E7进行了体外生长能力分析以及溶血试验，结果如图4.2所示，LAPD-E7的体外生长趋势同EGD-e和LAPD一致，并且LAPD-E7的溶血能力同LAPD相比无明显差异，远低于标准菌株EGD-e。因此得出结果，E7不会影响LAPD的体外生长能力和溶血能力。
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结论
1. 减毒单增李斯特菌LAPD毒力减弱且细菌在小鼠体内可以在一周内被清除。减毒李斯特菌保留较完整的免疫原性；
2. LADS和LADS-OmpW对嗜水气单胞菌感染有预防效果；
3. LAPD-E7对宫颈癌有抑制作用和预防作用。
参考文献（略）