第 一 章 引 言
糖尿病因胰岛素分泌异常和(或)胰岛素抵抗而引起糖类、蛋白质、水和脂肪等代谢障碍,久病可对机体血管、神经、皮肤等产生严重影响,引起多种糖尿病慢性并发症,严重威胁着人类的健康[1]。近些年,随着生活水平的提高与生活方式的改变,糖尿病的患病率逐年上升,且有不断扩大化和年轻化的倾向。糖尿病已是继心血管疾病和肿瘤之后排名第三的人类健康杀手,给社会与家庭带来沉重的负担。数据表明,截止 2013 年,全球糖尿病患者数已达到 3.82 亿,预计到 2035 年,全球糖尿病患者将达到 5.92 亿[2-4]。研究者对 1995 年至 2009 年北京协和医院住院糖尿病患者进行分析发现,内分泌科糖尿病患者的住院率达 40~60%[5],且高血糖是糖尿病患者住院的主要原因,占总住院因素的 61%[6]。治疗糖尿病的基础是控制高血糖。2013 年中国糖尿病指南推荐的中国 2 型糖 尿 (Type 2 diabetes, T2DM) 病 控 制 目 标 为 糖 化 血 红 蛋 白 (Glycosylatedhemoglobin, HbA1c)<7%;空腹血糖(Fasting blood-glucose, FBG) 4.4~7.0mmoLL-1;餐后血糖(Postprandial blood glucose, PBG) 10.0mmoL L-1 [7]。为了达到这个目标,对于所有糖尿病患者来说,当生活方式干预不能达到预期降糖目标时,降糖药物的加入是必须的。目前临床口服降糖药分为 6 大类:即磺脲类(Sulfonylureas, SU) 、 双 胍 类 (Biquanides) 、 葡 萄 糖 苷 酶 抑 制 剂 (glucosidaseinhibitors)、格列酮类(Thiazolidinediones, TZD)、非 SU 类胰岛素促泌剂及包括胰高血糖素多肽-1(Glucagon-like peptide 1, GLP-1)等的其他类。在这些降糖药物中,SU 类、非 SU 类胰岛素促泌剂类药物可刺激胰岛β细胞分泌胰岛素(Insulin, Ins);GLP-1 为肠道分泌释放的肠促胰岛素,可刺激 Ins 的分泌;而双胍类药物和 TZD类药物可分别作用于肝脏和外周来增加靶器官对 Ins 的敏感性。这些药物的降糖机制归根到底是基于 Ins 的降糖效果。故而对所有 1 型糖尿病(Type 1 diabetes,T1DM)患者和处于某些特殊状况(如口服降糖药失效、急性代谢紊乱、合并重症感染、消耗性疾病、外科治疗的围手术期、妊娠和分娩等)的 T2DM 患者来说,外源 Ins 治疗是控制高血糖的最直接最有效的手段[8]。
临床通过频繁监测血糖并根据其结果,每日多次皮下注射 Ins 的方式治疗糖尿病。这种方式给患者的生活带来诸多不便,频繁的注射会给病人带来极大的生理和心理痛苦,病人的耐受性和依从性较差,且这种治疗方式无法提供一种模拟人体生理 Ins 分泌模式的分泌过程,因此无法有效阻止一系列急、慢性并发症的发生。且皮下注射方式存在疼痛、出血、硬结等副反应[9],这使得患者自行皮下注射 Ins 时,易因操作问题导致 Ins 的吸收模式有一定的变异度,影响血糖的达标情况。不同于需长期维持体内血药浓度来达到治疗效果的其他药物,Ins 需要在合适的时间给予准确的剂量来确保血糖的平稳。我们需要的理想 Ins 治疗应该接近生理性 Ins 分泌的模式,包括基础和餐时 Ins 两部分,能覆盖全天 24 小时,无明显峰值,并避免空腹和餐前低血糖。为了达到这一目标,研究人员开始关注新的Ins 治疗方式。鼻腔给药、超声介导给药、口服给药甚至是皮下包埋等非注射 Ins给药途径开始受到大家的青睐。由于 Ins 是蛋白多肽类药物,具有分子量较大,半衰期极短,容易变性,脂溶性差以及生物利用度低的特点,加之制药技术及人体生理制约等原因,这些非注射给药途径仍处于实验研究阶段,并没有在临床中获得应用[10-17]。故此,研究人员开始更多的关注可减少给药次数的新型给药方式。葡萄糖敏感 Ins 传递系统素有“人工胰腺”之称,有望取代常规注射给药途径而成为一种潜在的糖尿病治疗方法。该体系能够模拟人体胰腺分泌 Ins 的生理模式,根据血糖浓度的变化“智能”地调控 Ins 的释放从而调节血糖水平。该系统还能感应外界刺激,如温度、pH、光等的变化并诱导自身产生结构上的变化来控制药物的释放,使载体具有传感器和效应器的功能。
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第 二 章 实验研究
第 1 章 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料试剂
葡萄糖购自 Alfa Aesar 公司;2-氨基苯硼酸(2-Aminophenylboronic acid,2-APBA)、3-氨基苯硼酸(3-Aminophenylboronic acid, 3-APBA)、4-氨基苯硼酸(4-Aminophenylboronic acid, 4-APBA)购自安耐吉化学试剂公司;N -(3-二甲基氨基 丙 基 ) - N - 乙 基 - 碳 二 亚 胺 盐 酸 盐(N-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC·HCL)和 N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxy succinimide, NHS)购自 Sigma-Aldrich 公司;胰岛素(猪胰岛素,26.5IU mg-1)购自徐州万邦金桥制药有限公司;聚(L-谷氨酸)-b-聚乙二醇(Poly (L-glutamic acid)-b-Polyethylene glycol, PGA-b-PEG) 通过文献报道合成[34,35],使用前透析。所有其他试剂和溶剂均为国产分析纯。
1.1.2 实验仪器
Bruker-400 核磁共振谱仪:瑞士 Bruker 公司;BIO-Rad Win-IR 型傅里叶红外光谱仪:美国加州 BIO-Rad 公司; JEM-1011 JEM-1011 透射电子显微镜:日本电子公司;Wyatt QELS 动态光散射仪:Wyatt Technology 公司;Flexi-dry 冷冻干燥机:美国 FTS SRSTEMS 公司;DZG-403 电热真空干燥箱:天津市天宇实验仪器有限公司;THZ-83 恒温振荡器:上海常思公司;85-1 磁力搅拌器:上海司乐仪器有限公司; BSA124S-CW 电子天平:赛多利斯科学仪器有限公司;PerkinElmer LS50B 型分光光度计:美国 Perkin Elmer 公司;岛津 UV-1700 紫外可见分光光度计:日本岛津仪器公司;H-600 透射电子显微镜:日本 HITACHI 公司;M2300 型二氧化碳培养箱:美国 SHELBON 公司;细胞培养板/细胞培养瓶/离心管:美国康宁有限公司;MULTISKANMK3 酶联检测仪:Thermo ELECTRON 公司;–80℃超低温冰箱:SANYO 公司。透析袋(截留分子量为 3500 及 7000)购买于上海源叶生物科技有限公司。
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1.2 实验方法
mPEG-b-PGA 的侧羧基的 GA 单元可与 APBA 耦合可得到聚乙二醇单甲醚-b-聚 (L-谷氨酸-co-谷氨酰胺基苯硼酸)(mPEG-b-P(GA-co-GPBA))(PGP)[36]。称取2g PGA-b-PEG 于 100mL 的圆底烧瓶,溶于 40mL pH=7.4 的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer, PB)中,磁力搅拌至完全溶解;称取 3.1183g 的 EDC HCL 和0.6305g 的 NHS,分别溶于少量 PB 中。将溶解好的 EDC HCL 溶液缓慢滴加入圆底烧瓶中,电磁搅拌,反应 30min 待羟基完全活化后在上述溶液中缓慢滴加NHS 溶液,持续搅拌 3h,缓慢滴加溶于二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide, DMF)的 APBA。APBA 与羧基的投料摩尔比为 84 / 140。将最终溶液在 10℃下搅拌 2天,将上述反应溶液装入透析袋中(3.5kDa),超纯水(Millipore, Milli-Q)透析 3天后冻干。
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第 3 章. 讨 论.....19
3.1 mPEG-b-PGA的简介.......19
3.2 PBA葡萄糖敏感原理.....19
3.3 PGP的合成...........20
3.4纳米凝胶的形成 ............21
3.5 Ins体外释放.........22
3.6PGP的生物相容性.........24
第三章 结 论......26
第 3 章. 讨 论
3.1 mPEG-b-PGA 的简介
聚氨基酸及其衍生物是一种合成类多肽,因其良好的生物相容性和生物可降解性被广泛应用于生物医学材料领域,如药物控制释放、抗菌材料、基因转染、组织工程等[39,46-50]。聚氨基酸材料的选择和制备成为近些年的研究热点。聚(L-谷氨酸)(Poly(L-glutamic acid), PGA)由天然存在的 L-谷氨酸通过酰胺键链接而成的,是一类合成多肽。PGA 的侧基为羧基高分子,侧羧基赋予 PGA 良好的 pH敏感性,其 pKa≈4.1[36,51-54],是药物载体的优异材料。PGA 可[32]通过正己胺引发 γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐(BLG-NCA)开环聚合得到聚(γ-苯甲基-L-谷氨酸酯)(PBLG), 进一步脱掉苯甲基保护得到 PGA(图 9)。限制聚氨基酸材料在生物医学材料领域应用的是其溶解性,大多数聚氨基酸在水中溶解性较差,其降解速度和周期不可控[55]。PGA 是疏水性材料,较差的溶解性使其应用有一定的局限性。研究发现,可通过向材料中引入其他有序共聚物来调控聚合物的降解速度和降解周期。聚乙二醇(PEG)是一种高分子化合物,广泛应用于医药、卫生和化工等众多领域。PEG 生物相容性较好,溶解性极佳,可溶于组织液中被机体迅速排除体外而不产生任何毒副作用,与其他聚合物耦合时,可赋予材料新的特性和功能。当将 PEG 和 PGA 耦合时,聚合物会具有两者优良性质,具有良好的生物相容性、缓释性和亲水性等[56]。
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结 论
1.以 EDC HCL 与 NHS 为催化剂,mPEG-b-PGA 与 APBA 聚合,常温条件下反应合成一种高分子聚合物;通过1H NMR、FT-IR 进行表征,证明可通过此种方法合成一种 PBA 基葡萄糖敏感材料,其结构稳定、准确。2.利用 PGP 的自组装形成葡萄糖敏感的纳米凝胶,通过 CMC、TEM、DLS 对 PGP的形态及性能进行表征,发现其粒径均一,在 pH=7.4 时粒径可随着周围环境葡萄糖浓度的升高而相应增大,证明 PGP 在生理 pH 下具有一定的葡萄糖敏感性。3.体外释放实验研究表明,包载 Ins 的纳米凝胶在体外释放呈二相模式,即快速释放阶段和缓慢释放阶段。Ins 释放快慢主要取决于周围葡萄糖浓度的变化。PGP包载的 Ins 释放速率能够随着周围环境葡萄糖浓度的升高而相应增加。4.MTT 法检测 PGP 的生物学活性,从细胞水平证明 PGP 生物相容性较好,有望成为葡萄糖敏感纳米载药载体。根据实验结果证,PGP 具有对周围环境葡萄糖浓度的刺激响应性,同时具有良好的生物相容性,结构稳定不易解离。因此 PGP 有望作为用于智能控释 Ins的生物材料来构建生物人工胰腺。
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参考文献(略)