基因芯片技术在男科生殖医学研究

1 基因芯片技术概述

1.1 基因芯片技术的发展

1990年,人类基因组测序计划(human genomeproject, HGP)在美国正式启动, 基因芯片计划相继开展, 美国许多部门、大学、重点实验室及制药公司参与了该项目的研发, 我国相继也成立了一大批基因芯片公司。随着基因组数据的增长以及分子生物学相关学科的快速发展, 基因芯片技术得到迅猛发展和广泛应用。

1.2 基因芯片技术的概念
基因芯片是生物芯片的一种, 又称DNA芯片或DNA微阵列, 是通过微阵列技术将高密度DNA片段阵列通过原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在基片(如尼龙膜、玻璃、塑料、硅片等)表面, 以荧光标记的DNA探针借助碱基互补杂交原理,进行大量的基因表达及检测等方面研究的技术。一张基因芯片可以固着成千上万个探针, 具有高通量、大规模、高度平行性、快速高效、高灵敏性和自动化的特点。

1.3 基因芯片的分类

1.3.1 按储存的生物信息类型分类寡核苷酸芯片、cDNA 芯片、PCR 扩增子探针芯片, 这是最常用的分类方法。寡核苷酸芯片探针长度较短, 一般为几十个碱基, 是通过采集已知基因组序列,经过特殊的探针设计和分析软件筛选,用DNA合成仪人工合成,常用于基因分型和突变检测;cDNA芯片是通过逆转录获得基因的编码区片段制备成的芯片,主要用于基因表达分析; PCR 扩增子探针芯片是通过分析已经测序的目标基因组上的保守或特征性的基因或DNA片段, 设计扩增引物, 进行 PCR扩增, 将获得的长度为几百至上千个碱基左右的扩增子作为芯片探针,常用于基因表达的分析。

1.3.2 按应用不同分类 可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片。

1.3.3 按基片的性质分类 可分为有机芯片(聚内烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜)和无机芯片(玻璃、硅片、陶瓷)。

1.3.4 按材质和功能分 元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片。
近年来, 基因芯片技术应用于 miRNA(microRNA)的研究有了重要突破。miRNA是一些长度为 22 个核苷酸左右的非编码调控 RNA 家族。
miRNA 具有同源性、保守性及特异性等特点, 通过影响蛋白质的合成参与调节生物细胞的发育。但是, miRNA只是总RNA样本中的一小部分, 只能为添加标记或设计探针提供很少的序列,用高特异性来标记比较困难。同时, miRNA 以 3 种方式存在: 小的成熟 miRNA、发夹状的 miRNA 前体、长的miRNA 前体。只有成熟的 miRNA 是有活性的, 因此, 需要剔除miRNA前体。用标准的芯片程序去分析 miRNA 比较困难。................

2 基因芯片技术在男性生殖医学研究中的应用

基因芯片技术在男性生殖医学研究和临床应用中具有广泛的前景。目前, 主要见于精子发生基因研究、精子功能研究、生殖毒理研究以及男性不育的诊断和治疗的研究。

2.1 在精子发生基因研究中的应用

精子发生是一个独特复杂的细胞分化过程, 其表达受严格的时间和空间调节,任何影响精子发生的因素都可能导致精子发生异常。因此精子发生的基因研究是生殖生物学领域中的一个重要课题。
Tang等应用基因芯片筛检Balb/c小鼠出生后不同时期睾丸的cDNA文库, 结果表明 ACRV1 在出生后 35 d、54 d 和 6 个月的小鼠睾丸中表达, 而在4 d、9 d 和 18 d 的小鼠睾丸中未表达, 并确定ACRV1 仅在小鼠出生后 35 d 的睾丸组织中特异表达。通过荧光免疫检验法和免疫组织化学染色显示, 人类ACRV1蛋白主要位于睾丸的圆形精子细胞和长形精子细胞中, 表明ACRV1在哺乳动物的精子发生过程中起着重要作用,并且可能会成为避孕疫苗的靶点。
近年来相关研究报道, 利用基因芯片技术发现了 NYD-SP12、NYD-SP6、NYD-SP9、NYD-SP16、Rtn-T、CLGN 等睾丸表达基因, 这些基因编码的蛋白都与精子的发生密切相关。Sha 等应用cDNA 微阵列技术筛查成人和胎儿睾丸组织的基因表达, 发现一种新的睾丸特异基因 TSP1, 蛋白分析显示其包含N-末端的bHLH和C-末端的Zip的2个功能区域, 在成人睾丸中高表达, 提示对人精子发生发挥重要作用。Zhou 等利用同样的研究方法发现了一种新的基因 TSG23/Tsg23, 并通过 RT-PCR、原位杂交、蛋白质印迹及免疫组织化学等方法验证了TSG23/Tsg23主要位于睾丸组织。此作者还比较了正常生育男性和无精子症患者睾丸中TSG23的表达, 结果显示, 梗阻性无精子症患者睾丸中 TSG23的表达少于正常生育力男性, 而在非梗阻性无精子症中则无表达。因此TSG23/Tsg23可以为无精子症的诊断和分类提供参考, 也预示着 TSG23/Tsg23 与人精子发生有关。
当精子发生基因出现突变或表达异常, 或调控的时间及空间异常, 就可能导致少精子症, 甚至无精子症。应用基因芯片技术, 可以对无精子症、少精子症进行分子病因学诊断,并可以进行大样本快速准确的遗传学筛查。
Y染色体上存在大量与精子发生相关的基因,其中在其长臂非荧光区域(Yq11,23)有一个无精子因子(azoospermia factor, AZF)基因位点, 由于该基因缺失患者多数表现为无精子症, 所以称为AZF基因。AZF基因缺失导致男性不育的遗传因素中排第2位, 仅次于Klinefelter综合征, AZF分为AZFa、AZFb、AZFc、AZFd等4个区域,其中以 AZFc 的缺失较多见(60%)。Zhu等对中国178例非梗阻性无精子症、134例少精子症不育男性和40例正常生育男性进行Y染色体检测, 结果显示 11.5%(36/312)不育患者中存在Y染色体微缺失, 其中AZFc微缺失所占比例最大(52.8%); 正常生育男性中未检测到Y染色体微缺失。目前检测Y染色体微缺失的技术灵敏、高效, 建议对此类患者在实施辅助生殖技术前进行Y染色体遗传学筛查。
cDNA微阵列技术可以应用于筛选非梗阻性无精子症相关基因的研究。Lin等通过cDNA微阵列技术筛查9例生精功能正常者和15例精子成熟障碍或唯支持细胞综合征患者的睾丸组织样本, 结果后者共有300个基因显著下调,并且证实其中10个是与生育相关的新基因(Hs.126780、Hs.553658、Hs.274135、Hs.268122、Hs.531701、Hs.171130、Hs.351 582、Hs.407480、Hs.552781、Hs.355570),大部分新基因在鼠和人类睾丸中的表达是特异性的,将为人类精子发生的研究提供新途径和方向。杨波等应用微阵列芯片对 10例正常人睾丸及39例非梗阻性无精子症睾丸组织中差异表达基因谱进行了研究, 获得128个可能与无精子症相关的差异表达基因, 其中56个基因表达上调, 72个基因表达下调,COX10下调明显, 原位杂交技术结果与 cDNA微阵列杂交相同, 说明COX10可能在无精子症的发生与进展过程中起重要作用。杨波等还应用基因芯片技术研究了RAP1A、钙黏附分子CDH18、PCDH17、细胞周期类分子在人无精子症患者和正常生育男性睾丸中的差异表达, 结果表明这些基因可能与睾丸精子发生和无精子症存在相关性。

3 总结

近年来, 男性不育的发病率逐年上升, 但是约30%~40%的生精功能异常病因不甚明了, 此时基因改变可能是这些疾病的重要原因。基因芯片技术的不断完善和应用,能为男性不育病因诊断提供先进的研究手段。目前, 基因芯片技术的研究存在一些难点, 比如基因序列信息缺乏、探针的合成与固定比较复杂、实验室操作标准化问题、费用过高和专利限制等, 尚需要进一步研究。

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