第一章 文献综述
1.1游离小孢子培养研究进展
在适宜的条件下，游离的小孢子可以从正常的配子体发育途径转向孢子体发育途径，发育成胚状体和双单倍体植株。获得由小孢子发育的双单倍体是作物育种和基础研究中一项重要的技术。与常规育种方法相比，游离小孢子培养技术具有以下优点：第一，通过游离小孢子培养方法获得纯合体只需要 1～2 年，大大节省了纯化的时间和工作量。第二，分离的小孢子具有极强的胚胎发生能力和植株再生潜力，是突变体产生的理想途径，可以提高选择效率。第三，小孢子再生植株不存在显性基因掩盖隐性基因的现象，表现型和基因型是一致的，可以提高选择的准确性，提高育种效率。第四，以杂交种为试材进行的游离小孢子培养得到的再生植株株系间性状变异幅度大，株系内性状整齐一致，世代间稳定性强，以此配制的杂交组合整齐性好，杂种优势强。
此外，通过小孢子培养技术构建的 DH 群体还可以用于分析形态性状的遗传和分子标记等。与花药培养相比，小孢子培养的优越性主要体现在以下几个方面：（1）游离小孢子培养中培养的是已经分离纯净的小孢子，排除了花药壁和绒毡层等组织对培养中小孢子细胞分裂、分化、发育的影响，所产生的再生植株，全部来自于小孢子；（2）培养期间各种外界因素可以直接作用于小孢子，因此是研究转化和诱变的理想材料；（3）便于系统观察小孢子在离体条件下的生长发育过程，是研究发育的极好的材料体系；（4）小孢子培养成功的基因型多，胚状体诱导频率也高。Maluszynski 等(2003)在详细地列出 33 种重要作物的培养方法，并指出 226 种作物的小孢子培养获得成功。如小麦（Triticum aestivum L.），大麦（Hordeum vulgare L.），小黑麦（× Triticosecale Wittm.），水稻（Oryza sativa L.），芸薹属植物（Brassica spp.），茄子（Solanum melongema L.），辣椒（Capsicum annuum L.），芦笋（Asparagus officinalisL.），和烟草（Nicotiana tabacum L.）（Thomas et al., 2003）。但到目前为止，只有四种作物被认为建立了模式体系（Maraschin et al., 2003）：甘蓝型油菜，烟草，大麦，小麦。有些作物的小孢子胚诱导率仍然很低，或者植株再生困难。
1.1.1芸薹属植物游离小孢子培养研究概况
Litcher (1982)从甘蓝型油菜中分离出小孢子开创了芸薹属植物游离小孢子培养研究。从此，许多学者致力于建立各种作物的游离小孢子培养体系，尽管这些年来取得了很多进步，但是很多作物仍然很难出胚，例如现在虽然有大量的关于拟南芥的基因组信息，但是目前没有关于这种作物的小孢子培养方法。国际上，日本学者 Sato（1989）首次报道成功地诱导出大白菜小孢子胚和再生植株。在国内，芸薹属蔬菜游离小孢子培养的研究开展较晚，但也取得了很大的进展。1992年，我国学者曹鸣庆等报道大白菜游离小孢子培养获得成功。之后，徐艳辉等（2001），轩正英等（2005），韩阳等（2005, 2006），周英等（2006）相继开展了大白菜游离小孢子培养研究，建立了较高效的培养体系。1993 年，李岩等在小白菜小孢子培养中获得了花粉植株。1996 年，李光涛等获得紫菜薹游离小孢子培养再生植株。1997 年，张德双等通过小孢子培养获得了绿菜花单倍体植株。1998 年，陈玉萍等首次在包心芥菜游离小孢子培养中获得单倍体植株。严准等(1999)首次报道了球茎甘蓝游离小孢子培养获得成功。此外芸薹属蔬菜嫩茎花椰菜、菜心、芥蓝、青花菜、羽衣甘蓝等的小孢子培养研究均有报道（王怀名等，1992；朱允华等，2003；何杭军等，2004；张延国等，2005；姜凤英，2006)。
截止目前，在几乎所有芸薹属作物上均有小孢子培养成功的报道。游离小孢子培养技术已成为芸薹属植物品种改良的一个重要手段。芸薹属种间杂种小孢子培养技术也在不断完善，石淑稳等（1993）对白菜型油菜(B．campesgris)和甘蓝型油菜(B. napus) F1、埃塞俄比亚芥(B．carinata)和甘蓝型油菜(B.napus)F1、埃塞俄比亚芥(B.carinata)和白菜型油菜(B．campesgris)加倍 F1进行小孢子培养获得了胚状体。周永明和 Scarth(1995，1996)对甘蓝型油菜和白菜型油菜种间杂种和甘蓝型油菜和芥菜型油菜种间杂种进行小孢子培养，获得了胚状体和再生植株，这些植株多数在形态上介乎两个亲本之间且具有不同染色体数目。卢钢等（2001）在 6 份以白菜为母本，芜菁为父本的杂种中，有 5 个杂种获得了胚状体。陈文辉等（2006）对甘蓝(Brassica oracea var．capitata)×青花菜(Brassica oleracea var.italica)的 20 个杂种进行游离小孢子培养有 14 个能产生胚状体，且有一部分胚状体形成了完整的再生植株。
第二章 大白菜永久变异群体的创建
用于植物基因组作图的永久变异群体主要包括重组自交系和双单倍体株系。大白菜属于典型的异花授粉植物，采用连续自交方法创建重组自交系需要较长的时间。利用小孢子培养技术可以快速获得双单倍体（doubled haploid）纯系，因此，本项研究采用游离小孢子培养方法创制 DH 系获得永久变异群体。自从Lichter (1982) 首次获得甘蓝型油菜的小孢子植株后，游离小孢子培养技术在芸薹属各种蔬菜中也获得了成功。包括大白菜(B. rapa L. pekinensis, Sato et al., 1989;Baillie et al., 1992)，小白菜(B. rapa L. ssp. chinensis, Cao et al., 1994; 冯辉等, 2009a)，菜心(B. campestris ssp. parachinensis, Wong et al., 1996)和紫菜薹(B. campestris ssp.chinensis var. purpurea Hort., Wang et al., 2009)。但是与甘蓝型油菜(Zhou et al., 2002; Guet al., 2004; Xu et al., 2007; Leroux et al., 2009)相比，在芸薹属蔬菜上游离小孢子培养技术并不是很成功(Guo and Pulli, 1996)。因为，现在已有的体系并不能简单的应用于所有的育种材料，所有有必要对小孢子培养技术加以优化。虽然前人在提高难成胚基因型品种的小孢子胚状体发生率和体系建立方面做了很多研究(Cao et al., 1994; Wong et al., 1996; Wang et al., 2009) ，但是已经一些品种仍然难以诱导成胚，例如 Pall and Vallti 和品种。胚状体发生率最高（61胚/蕾)的品种是浙江的品种Maoshan（Gu et al.,2003）。小孢子培养受很多因素影响，例如供体植株的生长条件，小孢子的发育阶段，预处理的方法，培养基组成和接种小孢子的密度(Palmer et al.,1996)。植物育种中需要很高的成苗率。基因型(Mathias, 1998)，培养基(Chuong andBeversdorf, 1985; Gland-Zwerger, 1995)，转移到固体培养基上胚状体的阶段(Niu etal.,1999)都影响胚状体成苗。但是，在以前的研究中胚状体成苗率很低，仅为5~10%(Satoet al., 1989)和7.6%（B. rapa L. ssp. chinensis, Cao et al., 1994）。为实现高效率地获得双单倍体(DH)纯系，使这一新的方法能成功应用于育种实践和为数量性状遗传研究构建遗传图谱而建立作图群体，本研究对大白菜培养基配方的改良，高温热激处理温度和时间，成苗率，自然加倍率进行了研究。
第三章 大白菜分子遗传图谱的构建...................... 41-55
3.1 材料与方法..................... 41-45
3.1.1 实验材料..................... 41-42
3.1.2 试验方法..................... 42-45
3.2 结果与分析..................... 45-51
3.2.1 亲本间分子标记的多态性分析 .....................45-48
3.2.2 遗传图谱的构建 .....................48-51
3.3 讨论..................... 51-54
3.3.1 关于作图群体..................... 51-52
3.3.2 关于分子标记的选用 .....................52-53
3.3.3 关于标记的偏分离..................... 53
3.3.4 与及发表的图谱的比较和染色体..................... 53-54
3.4 小结..................... 54-55
第四章 大白菜植株和叶部形态性状..................... 55-69
4.1 材料与方法..................... 55-56
4.1.1 实验材料..................... 55
4.1.2 试验方法..................... 55-56
4.2 结果与分析 .....................56-65
4.3 讨论..................... 65-68
4.4 小结 .....................68-69
第五章 大白菜叶部颜色性状 QTL 分析..................... 69-85
5.1 材料与方法..................... 69-70
5.1.1 实验材料..................... 69
5.1.2 试验方法 .....................69-70
5.2 结果与分析 .....................70-82
5.3 讨论..................... 82-84
5.4 小结..................... 84-85
结论
1. 为建立高效的大白菜游离小孢子培养体系，构建永久作图群体，以 13 个大白菜杂交种为试材，对大白菜游离小孢子培养的关键技术做了研究。不同基因型材料间小孢子胚状体发生率不同，小孢子胚状体发生率最高的为 10.6 胚/蕾，一个基因型不能产生胚状体。高温热激处理对提高胚状体诱导率作用显著，33℃处理 24h 或 48h 对于胚状体发生比 72h 更为有利。在 NLN-13 培养基中加入 6-BA 和 NAA 可以显著提高胚状体发生率，以‘0.1 mg•L-16-BA + 0.05 mg•L-1NAA’效果最好，胚状体发生率是未添加激素的2~3 倍。抗生长素 PCIB 对提高胚状体发生率和直接成苗率具有显著作用，最佳的浓度是 40μM，可使胚状体发生率提高 3.4~6.2 倍，直接成苗率提高 9.6 倍，PCIB 对胚状体形成次生胚也都作用。胚状体转胚时间以 21d 胚龄为宜。本研究成苗率最高的基因型可以达到 67.4%，平均自然加倍率可以达到 57.5%。
2. 用不同生态型的两个大白菜自交系配制的杂交种进行游离小孢子培养，获得了192 个 DH 系。为其为作图群体，采用 SSR 和 SRAP 两种标记技术，通过 Joinmap 3.0软件构建了一张永久性的遗传连锁图，包含 233 个标记，SSR 标记 43 个、SRAP 标记190 个，长度达到 1063.8cM，平均图距为 4.6cM，标记间的最大间距为 18.0cM，最短的为 0cM。共 10 个连锁群，每个连锁群上的标记数在 14~32 个之间，长度在 38.2~150.5cM范围内，利用 SSR 标记锚定可以与染色体对应。在 233 个多态性标记中，149 个(63.9%)显著偏离孟德尔 1:1 遗传分离比率，各连锁群上偏分离标记比例不同。
3. 以 233 个分子标记的大白菜分子遗传图谱为框架，在沈阳和大连两地对大白菜的形态性状包括株高、株幅、外叶长、外叶宽、叶形指数、叶柄长、叶柄宽、叶柄厚 8 个性状进行了QTL定位和遗传效应分析。采用基于混合线性模型的复合区间作图法的QTLnetwork 2.0 软件，在 9 个连锁群上定位了 37 个形态学相关的 QTL，检测到 4 对上位性QTL，分布在 A05，A06，A08，A09 连锁群上。其中控制株高的 QTL 有 4 个，控制株幅的 QTL 有 3 个，控制外叶长的 QTL 有 7 个，控制外叶宽的 QTL 有 6 个，控制叶形指数的 QTL 有 4 个，控制叶柄长的 QTL 有 2 个，控制叶柄宽的 QTL 有 5 个，控制叶柄厚的 QTL 有 6 个。各 QTL 贡献率不同，在 5.09%~31.37%之间，24 个 QTL 的贡献率大于 10.00%。贡献率最高的是控制外叶宽的 QTL，在 A10 连锁群上。相关性状 QTL 的位置往往集中在连锁群上相同或相近的区域，控制株高和外叶长的 2 个 QTL 位于 A08的相同位置（73.9cM），控制外叶长和叶柄厚的 2 个 QTL 均位于 A05 连锁群的 33.4cM处，控制外叶长和叶柄长的 2 个 QTL 均位于 A10 连锁群的 0.0cM 处，控制外叶宽和叶柄厚的 2 个 QTL 位于 A06 连锁群上 12.7cM 处。外叶宽和叶柄宽在两地都检测到相同位置的 QTL。
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