第一章绪论
1.1食物过敏及其危害
最新关于美国食物过敏儿童的调查结果显示，目前18岁以下的儿童中有近590万人患有食物过敏症，其中39%的人过敏症状严重，而30%以上的人对多种食物过敏，尤其是坚果类食物。2008年，疾病控制中心预测，食物过敏问题将会影响1/25的儿童，而现在已经达到了1/13,更为严重的是，许多儿童对多种食物都存在过敏现象，并且已经产生了严重的反应，患病率呈逐年增加的趋势。而近期的调查结果证实食物过敏在总人口中发病率已经达到4%。
1.1.2食物过敏危害
食物过敏因其免疫学机制的作用会引起一系列的过敏症状，轻则感觉不适，：重则危及生命。临床上主要引发以下并发症：皮肤性疾病（荨麻疫，血管性水肿，湿疫等)、呼吸道疾病（哮喘，吸入性鼻炎等）、胃肠道疾病（呕吐，腹湾，腹部：绞痛等)、：神经系.统疾病(过敏性休克等心血管症状）。而针对某些豆类、坚果类、蛋类、奶类以及鱼类等食；物的过敏反应甚至可以危及生命。
目前，避免食物过敏现象发生的常见方法主要是禁止食用含有过敏原的食物，但是长期这样往往会引起过敏人群摄入营养素不足，导致营养不良，如1-9岁儿童食物过敏患者中，興、铁、锌、维生素D、维生素E的摄入量低于RDA规定值，仅为规定值的67%。因此，食物过敏已经严重影响着过敏患者的日常饮食和生活质量。
1.1.3食物过敏原及其特点
过敏原又称致敏原或变应原，是指能使某些特定人群产生过敏现象的抗原。对过敏患者健康构成威胁的食物过敏原主要来自食物中具有致敏性的蛋白质、食品加工储存中使用的食品添加剂以及含有过敏原蛋白基因的转基因食品。过敏原中90%都是蛋白质，但并非所有蛋白质都会引起过敏现象，具有抗原特性的蛋白质大多数为糖蛋白，分子量在10-70KDa范围内，分别属于不同的蛋白质家族。过敏原蛋白等电点大多小于7，通常在食品加工过程中表现出一定的稳定性，如加热或烹调过程，甚至有些过敏原能抵抗肠道的消化作用。
过敏原蛋白分子具有紧凑的三维结构，大多具有配位键、二硫键以及糖基化等结构特点；许多过敏原之间具有共同或相似的抗原表位，导致过敏时存在交叉反应食物过敏有一定的遗传性，双亲中一方有过敏史，则子女患病率为20-30%，如双亲都有过敏史则子女的患病率高达80%。由蛋白质引起的过敏反应多变态反应。能引起特定人群产生过敏的食物有多种，而对某些过敏食物而言,其含过敏原的种类也很复杂。2004年美国食品药品监督管理局提出了 160多种产品需要标示的食物过敏原，其中牛乳、鸡蛋、鱼、贝类、花生、大豆、坚果以及小麦被作为八大主要过敏原，这些产品的含量占总量的90%左右。各种环境危险因素在食物过敏原的发展进程中也起到很大的作用，随着工业化进程的提高，环境污染的严重，过敏原的种类逐渐增加，过敏症状种类增多、病情逐渐加重。
1.2牛乳过敏及其主要过敏原
1.2.1牛乳过敏
牛乳是人们日常生活中经常摄入的营养物质，由此引起的食物过敏现象引起了广泛的关注。牛乳过敏患者发生过敏反应时，临床症状多表现为皮肤點膜病变、呼吸系统病变如呼吸急促、喘息、咳嗽以及胃肠道系统紊乱等严重者甚至产生过敏性休克直接威胁生命。婴儿在4-6个月后为满足营养要求，需要摄入一定量的辅助营养食品，而氨基酸含量丰富的牛乳及其乳制品优选为婴幼儿的主要营养食品之一。因此，食品中牛乳过敏原的检测尤为重要，特别是低致敏食品中牛乳过敏原的检测。调查表明，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3-7.5%，而在儿童中的发病率达0.1-7.5%，其中一岁以下的婴幼儿中的发病率达到2-3%。牛乳过敏不同于花生过敏，不是一种终身的过敏现象，随着年龄的增加有些患者会产生免疫耐受，过敏现象甚至逐渐消失，如3岁以上儿童中的牛乳过敏发生率就降低到0.3%左。不同国家的学者对引起牛乳过敏反应的过敏原蛋白剂量进行了研究，结果表明：不同体质的个体引起过敏反应的牛乳致敏蛋白剂量不同。乳清蛋白作为一种常用的食品添加剂应用于食品工业当中，增加了食品中存在潜在牛乳过敏原的可能性。牛乳过敏也影响着其它与食品生产无关的产业，如化妆品、医药行业等，导致相关产品也会引起过敏患者产生过敏反应。因此，建立快速、灵敏、特异性的牛乳过敏原检测方法是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的生活质量。
第二章牛乳a-乳白蛋白的分离纯化
2.1引言
牛乳含有丰富的蛋白质，是人们日常生活中营养物质主要来源之一，而a-乳白蛋白因其含有大量的色氨酸，被认为是牛乳中优选的营养物质。a-乳白蛋白约占牛乳乳清总蛋白的20%，含有123个氨基酸，3种基因型，分子量约为14.4kDa,是一种包含有4个二硫键的球状结构的蛋白质。牛乳a-乳白蛋白与人乳a-乳白蛋白的氨基酸残基有很高的相似度,对初生婴儿来说是一种很重要的蛋白质来源，但该蛋白又被认为是牛乳中主要的过敏原之一。本章釆用常规方法对牛乳进行脱脂、等电点沉淀法除酪蛋白，采用离子交换层析与凝胶过滤层析相结合的方法纯化a-乳白蛋白，以SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，Lowry法测定蛋白浓度，得到高纯度a-乳白蛋白为单抗的制备和样品检测提供原料保障。
第三章 抗牛乳α-乳白蛋白单........................... 32-48
3.1 引言........................... 32-33
3.2 材料与仪器........................... 33-34
3.2.1 主要材料 ...........................33
3.2.2 主要试剂 ...........................33
3.2.3 主要仪器........................... 33-34
3.3 主要溶液的配制 ...........................34-36
3.4 实验方法........................... 36-40
3.5 结果与分析 ...........................40-45
3.6 讨论 ...........................45-47
3.6.1 动物的免疫........................... 45-46
3.6.2 单抗的制备........................... 46-47
3.6.3 抗体的纯化及其特性 ...........................47
3.7 本章小结........................... 47-48
第四章 荧光量子点标记单克隆抗体........................... 48-59
4.1 引言........................... 48-49
4.2 材料与仪器........................... 49
4.2.1 主要试剂 ...........................49
4.2.2 主要仪器........................... 49
4.3 主要溶液的配制........................... 49-50
4.4 实验方法........................... 50-51
4.5 结果与分析........................... 51-56
4.6 讨论........................... 56-57
4.7 本章小结........................... 57-59
第五章 量子点标记单克隆........................... 59-71
5.1 引言........................... 59
5.2 材料与仪器........................... 59-60
5.2.1 主要试剂........................... 59
5.2.2 主要仪器........................... 59-60
5.3 主要溶液配制 ...........................60
5.4 实验方法........................... 60-63
5.5 结果与分析 ...........................63-69
5.6 讨论........................... 69-70
结论
本文釆用色谱层析法从牛乳乳清中纯化a-乳白蛋白，并以此为抗原免疫小鼠，通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞，然后经过筛选、亚克隆、有限稀释及腹水诱生法制备单克隆抗体，辛酸硫酸铵联合沉淀法纯化腹水得到单抗；在此基础上釆用EDC、NHS偶联剂将得到的单克隆抗体与表面羧基修饰的荧光量T点CdSe/ZnS共价结合，并采用Sephadex-G200凝胶过滤层析实现分离纯化，最后将所得到量子点标记单抗进行特异性验证，并以此为原料对食物中过敏原a-乳白蛋白的检测进行深入的研究。
(1)釆用DEAE-SepharoseFast Flow弱碱性阴离子交换树脂和Sephadex G-75相结合的方法实现了牛乳中（X-乳白蛋白的分离纯化，所得到的a-乳白蛋白纯度大于95%,得率约为20.5%，可满足后续单克隆抗体制备时免疫小鼠所需纯度及用量。
(2)以纯化得到的a-乳白蛋白为抗原免疫小鼠，以ELISA法检测免疫小鼠血清效价，当小鼠血清效价达到10万以上时，宰杀免疫小鼠制备脾脏细胞悬液。采用细胞融合技术对脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合，并对融合所得杂交瘤细胞进行观察及筛选，取强阳性孔细胞亚克隆培养，最终得到单克隆抗体22株，选取长势良好细胞株，采用体内诱生腹水法制备富含单克隆抗体的腹水，ELISA法检测腹水效价达到3xl05,通过辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化腹水中单抗，利用SDS-PAGE电泳表征所得单抗纯度，同时，采用间接竞争ELISA、免疫印迹评估单抗的活性和特异性，结果显示：所得单克隆抗体的活性好且特异性高，与牛乳中其它主要过敏原蛋白无交叉反应，为后续量子点标记提供了较为理想的材料保证。