第一章文献综述
1问题的提出和研究意义
有关克服连作障碍的大量研究主要集中在改善土壤生境如稻草还田、水肥顆合、轮间套作等农艺措施方面，而在烟草根系分泌物对连作的响应机制及调控方面研究却较少，本文采用先进化学分析手段（气相色谱质谱联用）和生物技术手段（PCR-DGGE)来研究对烤烟根际分泌物组分及其与土壤养分、土壤酶活性、土壤微生物群落多样性之间相关性，可为烟区种植制度改革、新品种选育、土壤消毒剂研制、根土微生态环境技术优化以及病虫害防治提供理论与技术支撑。
2国内外连作障碍产生机制及其调控研究进展
2.1 土壤养分及酶活性对连作的响应
土壤养分失衡是导致连作障碍的重要因素，由于作物对土壤养分具有特定的选择性吸收规律，特别是对其中某些中、微量元素有着特殊需求，长期连作往往造成施肥具有固定性，易造成土壤养分的不均衡，从而致使作物体内各种养分比例失调而出现生理和功能性障碍。合理轮作是缓解土壤养分平衡的有效手段，作物不同，吸收营养物质的种类和数量就不同，收获后土壤中残留的有效养分也不同。
2.1.1 土壤pH对连作的响应
土壤pH与土壤化学和生物化学反应以及微生物活动密切相关，进而影响土壤养分的转化和生物有效性。作物常常根据自身的需要对外界环境中的养分有高度的选择性，当土壤中施入某种肥料后，由于植物具有选择吸收的特性，就必然出现吸收肥料中阴阳离子不平衡的现象，从而影响土壤pH值。大部分研究表明连作降低土壤pH缓冲能力，不利于土壤养分供应和对养分的吸收，进而影响作物的生长发育和产质量。张科（2010)对比了 6年连作和轮作烤烟植烟土壤pH值，连作使土壤pH值由5.81降至5.23，而轮作玉米土壤pH值无显著变化。马海燕（2011)测定了种植在日光温室中非洲菊不同连作年限土壤pH值，连作土壤pH总体呈下降趋势，连作7年的土壤pH比连作1年的下降了 0.11个单位，土壤容重也随之降低，原因可能是温室中密闭状态下使土壤水分平衡改变，由于施肥量较大，导致土壤的盐绩化，进而导致pH变化。郭红伟（2011)测定了对温室种植不同年限辣椒土壤进行的pH值，表明土壤pH值具有明显下降趋势，土壤酸化可能是因为有机肥施用量相对减少，土壤缓冲能力降低，长期超量施用单一化肥，尤其是生理酸性肥(如硫酸钾)和化学酸性肥料（如过憐酸耗）所造成，还可能是因为氮肥及精细有机肥施用量相对较多，土壤中积累了大量的氮素，绝大部分被氧化成NCV (林德，2003)
2.1.2土壤有机质对连作的响应
土壤有机质含量是土壤肥力高低的指标之一，是一种稳定而长效的氮源物质，在微生物参与下，经过腐殖化作用形成土壤腐殖质，提高土壤保肥能力。关于有机质对连作的响应，不同研究报告结论不同。贡挪（2011以不同连作年限棉田为研究对象，测定了不同年限土壤有机质，连作12年棉田土壤有机质含量最高，连作20-30年后，有机质又会降低到初始水平，虽然耕作初期由于作物的调落物残体分解补充了土壤中的有机质，但作物在生长过程中也会吸收大量土壤养分，而返还到土壤中的有机物较少，因此多年连作垦殖的棉田越来越接近荒地的有机质含量。周科(2011)测定了凤丹根际土壤有机质对连作的响应，各年限根际土壤有机质均显著高于非种植土壤，但连作时间越长，有机质含量越低，可能是长时间连作使土壤酚酸类物质产生积累，土壤根际环境酸化，加剧了酶活性降低，减少了根际土壤中腐殖质和有机质的形成。马海燕（2011) 测定了大棚中不同连作年限非洲菊土壤有机质，土壤有机质含量随连作年限的增加而上升，可能与施肥措施有关。大棚连作辣椒土壤有机质含量增加程度随连作年限延长而增大，可能是化肥和有机肥投入量过大，超出了蔬菜生长的吸收能力。
土壤酶活性是土壤微生态环境中重要生理活性指标，常常用来评价土壤微生态环境的变化，越来越受到人们的重视。过氧化氧酶和多酸氧化酶属重要的氧化还原酶，是土壤腐殖化的媒介。脲酶催化尿素水解成氨影响土壤中尿素的有效性。转化酶活性与土壤中有机质、N、P含量、微生物数量、土壤呼吸等均有一定关系，常用来表征土壤的熟化程度，磷酸酶活性可作为作物磷素丰缺的指标（贡聰，2011) [11]。刘素慧（2010) [13]采用盆栽法研究不同年限连作大蒜土壤酶活性变化，表明各种酶活性（过氧化氧酶、多酔氧化酶、脲酶、磷酸酶和鹿糖酶）变化均呈倒“马鞍”形，峰值出现在第10年。古战朝（2011)[】4]对连作3-8年植烟土壤进行了酶活性测定，表明土壤脲酶、磷酸酶、鹿糖酶活性以3年最高，其次为正巷，连作8年最低，说明随连作年限的增加，土壤酶活性先升高后下降，而长期连作会降低土壤酶活性，与根际土壤微生物数量变化相一致。马海燕（2011) [8]对大棚连作非洲菊土壤酶活性测定表明，土壤脲酶或鹿糖酶活性呈先升后降的趋势，连作1年和3年土壤酶活性降低，连作5年后又升高，土壤过氧化氧酶和中性磷酸酶活性呈下降趋势，但蛋白酶呈增加趋势。张科（2011) [6]通过测定不同连作年限植烟土壤酶活性，表明连作抑制了脲酶和庶糖酶活性，但增加了过氧化氢酶活性，原因连作土壤中氧化作用较强，根际微生物代谢活跃，过氧化氧分解较快，对根系的毒害较弱，在一定程度上可以缓解烤烟连作障碍。
第三章 植烟土壤酶活性对连作............................26-31
1 材料和方法........................... 26-28
1.1 采样地点........................... 26
1.2 试验设计........................... 26
1.3 土壤养分测定方法 ...........................26-27
1.4 土壤酶活性测定方法........................... 27-28
2 结果与分析 ...........................28-30
3 结论........................... 30-31
第四章 连作和轮作烟田根际...........................31-38
1 材料与方法 ...........................31-33
1.1 研究区概况 ...........................31-32
1.2 样品采集和制备........................... 32
1.3 提取液有机化合物的GC-MS分析........................... 32-33
2 结果与分析 ...........................33-37
3 结论 ...........................37-38
第五章 湖南浏阳烟区连作与轮作...........................38-47
1 材料与方法 ...........................39-40
1.1 供试材料........................... 39
1.2 试验设计........................... 39
1.3 土壤细菌和真菌群落多样性分析方法........................... 39-40
1.4 DGGE图谱分析........................... 40
2 结果与分析 ...........................40-45
2.1 DNA的提取和PCR扩增........................... 40-41
2.2 细菌群落多样性分析 ...........................41-42
2.3 16SrDNA序列分析 ...........................42-44
2.4 18SrDNA序列分析........................... 44-45
3 结论 ...........................45-47
结论
应用气相色谱与质谱联用测定技术，测定分析了连作与轮作根际土壤有机酸性组分含量及差异，结果发现连作根际土壤中有机酸性组分中的酸类物质多于轮作土壤，验证了前人对连作土壤酸化理论，充实了连作障碍理论依据。应用聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳技术，对植烟根际土壤细菌16 S rDNA片段进行了分析，结果发现连作和轮作根际植烟土壤细菌群落多样性有所差异，连作栽培模式降低了土壤细菌群落多样性。取胶带中特异性片段进行了测序，将条带序列在美国Genebank！进行了注册，用BLAST程序将所测序列与已知细菌片段序列进行比对，结果表明，连作与轮作烤烟根际土壤细菌群落种类及其功能有所差异，这可能与地理环境和栽培因素有关。
连作障碍由众多因素所引起的，许多因素是相互关联并协同作用于烤烟生长，而本文仅分别研究了各主要因素对连作的响应。酞酸酷类物质是一种增塑剂量，这可能与农业生产中应用大量塑料地膜残留有关。这类环境污染物对烤烟生长的具有胁迫效应，但对烤烟品质的影响尚未见报道。土壤中的有机污染物可通过根际细菌或真菌得到降解，但究竟是哪种细菌或真菌可降解污染物尚不明确，今后需将细菌或真菌进行筛选，选出可降解有机物的细菌或真菌并应用到生产。由于土壤是一个大反应池，在其反应异常即连作障碍出现后，采用轮作或休闲的方式可调节其反应强度。各种植物或动物及昆虫病害物质或化感物质进入土壤后，将会影响到土壤自身化学物质的组分及含量，当化学物质累积到一定浓度后便影响到植株本身生长。