第一章综述
1.1崇明东滩和太仓研究概述
崇明东滩是处于长江河口的中国重要的湿地，成陆己有1300多年历史，现有面积1267平方公里，崇明岛东、北方滩地仍在继续淤涨，其中东滩每年以100余米的速度向东海推进。该岛是我国乃至世界上最大的河口冲积岛，全岛超过50%的面积是由过去半个多世纪内滩涂淤积和围垦而成。
土壤基本经历过不同程度的盐渍化过程，但大多己自然脱盐，碳酸盐含量较高。虽然湿地围垦在全球范围内具有悠久的历史，但崇明岛湿地及垦区具有极为难得的独特性。由于崇明岛湿地的快速淤积，解放后的围垦强度达到每2一3年即有一次，从而在不大的空间范围内形成一个明显的土壤年代序列。据记载20世纪50年代开始进行大规模围垦，面积己达到了73，500hm半。即使该岛南部较古老的土壤，也存在明显的先后成陆年代序列。土壤年代序列是土壤及生态系统演变的极佳研究对象，因此，崇明岛是研究土壤不同发育阶段的极佳场所。太仓属长江三角洲冲积平原，位于江苏省东南部，长江口南岸，东濒长江，与崇明岛隔江相望。全境地势平坦，自东北向西南略呈倾斜。东部为沿江平原，西部为低洼好区。该地属于北亚热带南部湿润气候区，四季分明，雨水充沛，无霜期较长，日照充足。项目区的土地利用程度较高，根据太仓市国土资源局2007年10月31日土地利用变更调查资料，项目区土地垦殖率为65.23%、土地利用率为84.92%和耕地复种率为180%。长期以来，由于农户的粗放经营，耕作措施不合理，尤其是近年来的掠夺式经营和滥施无机肥，使土壤中的物质和能量转换失衡。在耕作制度上，忽视作物之间的轮作换茬的安排;在施肥管理上，忽视有机肥与磷、钾肥的补充，造成土壤理化性质下降，有机质含量降低，耕地质量不断下降，严重影响土地生产力的发挥。所以选择太仓大棚用于土壤过度利用的研究。
1.2土壤发育和土壤过度利用
土壤发育作为土壤学的基础研究，已经有悠久的历史。19世纪90年代初土壤发育被看成各种化学反应的总和，着重用化学原理研究土壤发生过程中的化学变化161，缺乏生物过程对土壤发育的影响，也忽略了土壤发育的生态学意义。为了全面地研究土壤发育，利用土壤时间序列对一系列土壤微生物演替进行研究。1999年ohtonen的研究表明到微生物演替后期，群落逐渐由细菌转为真菌主导171。2002年Sigler的研究表明，土壤微生物优势种的丰富度和均匀度都随演替而下降。2009年schotte证明了细菌演替的存在，同时发现细菌群落结构的演变与土壤时间序列无关，而与土壤深度有关。经过一系列的研究后土壤发育可以定义为:土壤从一定状态的土壤基质(Substrate)开始，土壤系统中非生物(土壤矿质部分)及生物因素(土壤有机质、土壤生物)在各种生态过程的驱动下随时间所发生的整体、协同性演化。
土壤过度利用导致土壤退化是指在人类活动或某些不利自然因素的长期作用和影响下，土地生态平衡遭到破坏，土壤和环境质量变劣，调节再生能力衰退，承载力逐渐降低的过程。土壤利用对土壤微生物，土壤养分，土壤酶活性，土壤物理性质等影响[川，过度利用即是对这些造成负担，破坏其中的稳定性。
1.3土壤微生物群落结构
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，它们参与土壤有机质周转，氮循环，养分释放，腐殖化，降解污染物和维持土壤结构等过程。一直以来科研工作者们很热衷于对土壤微生物群落结构和功能的研究。土壤微生物群落结构组成及活性变化是衡量土壤质量、维持土壤肥力和作物生产力的一个重要指标。由于土壤微生物群落结构组成复杂，数量巨大，对其研究的难度较大。
影响土壤微生物群落结构发生变化的因素很多，如土壤耕作方式、水分管理的改变、外援化学物质、有机肥、化肥的应用、以及接种外援微生物等都对土壤微生物的群落结构产生一定的影响，但决定一种土壤微生物群落结构多样性的主导因素还是与土壤本身的理化性质和植被状况。主要有植被类型:植物是土壤微生物生长发育的主要驱动力，土壤类型:为土壤是土壤微生物的栖息地，它的质地结构、有机质含量、pH值、土壤营养元素供给等都会对土壤微生物产生影响和土壤管理制度决定的。土壤微生物群落结构是评价土壤质量的一个敏感指标。所以，在农业发展中应该选择轮种的方式，不同的土壤类型对微生物的群落结构影响很大，土壤中微生物群落结构越复杂越丰富，则土壤生态系统越稳定，系统的生态功能越高，对外界环境变化的缓冲效应越强。
第二章崇明东滩不同发育土壤微生物多样性研究
2.1前言
真菌在生态系统功能中起着重要的作用，尤其在森林和水田土壤中。真菌在大多数真核生物中起着降解者，突变体和病原菌的作用。据估计有150万的真菌种群，然而已被描述的物种接近70，000种，还剩95%是未被描述的。
基于PCR技术的分子生物学方法，核糖体DNA序列有效的评估物种丰度，并对影响群落结构和多样性136一38j的生态过程提供了见解。内转录间隔(ITS)区域基因和5.8:rRNA基因相比较185和25SrRNA基因更利于测定真菌系谱关系，因为ITs部分的基因个更能显示种间差。近来，ITs区域被广泛的作为多种真菌鉴定的有效oNA标记。2005年。Brienetal.通过改良测序技术对ITS大规模的Sanger测序进行定量和鉴定土壤真菌多样性并建立了DNA数据库哪。目前为止，高通量测序方法仅用于评估森林土壤真菌群落的丰度，其它类型的土壤还未实验过。
第二章 崇明土壤微生物多样性研究............................................... 18-36
2.1 前言............................................... 18
2.2 材料与方法 ............................................... 18-26
2.2.1 材料 ............................................... 18-20
2.2.2 方法............................................... 20-26
2.3 结果 ............................................... 26-34
2.3.1 真菌群落多样性分析............................................... 26-30
2.3.2 理化性质与主要真菌的关系 ............................................... 30-31
2.3.3 不同年代土壤的定量分析 ............................................... 31-34
2.4 讨论 ............................................... 34-35
2.5 小结 ............................................... 35-36
第三章 过度利用的耕地土壤研究 ............................................... 36-63
3.1 前言 ............................................... 36
3.2 材料和方法............................................... 36-38
3.2.1 采样 ............................................... 36
3.2.2 试剂与试剂盒............................................... 36-37
3.2.3 实验仪器............................................... 37-38
3.3 方法............................................... 38-52
3.3.1 理化性质的测定............................................... 38-39
3.3.2 土壤总DNA提取 ............................................... 39-40
3.3.3 细菌,真菌,古生菌基因PCR扩增............................................... 40-43
3.3.4 克隆文库的建立及测序............................................... 43-44
3.3.5 定量标准品的制备............................................... 44-49
3.3.6 定量标准曲线的制作............................................... 49-52
3.4 结果分析............................................... 52-60
3.4.1 理化性质............................................... 52
3.4.2 通过分子生物学方法研究............................................... 52-60
3.4.3 定量结果............................................... 60
3.5 讨论............................................... 60-62
3.6 小结............................................... 62-63
结论
太仓大棚样品是土壤过度利用的其中一种方式。土壤的过度利用不仅对土壤的物理化学性质有影响，对于农业而言，更是对农作物经济造成一定的影响。
本实验选用太仓4个不同的样品用建克隆文库的方法来研究其细菌，真菌和古菌的群落结构。细菌的4个样品都建克隆文库，真菌和古菌选取了太仓2(五年)和太仓3(一年)进行了比较。从结果中可以看出细菌群落结构，太仓2的浮霉菌门和TM7是独有的，但因为其克隆数目的稀少所以不能确定此两种细菌是太仓2样品特有。同理太仓4(宅基地转化)的Verrucooicrobia也是如此，但是太仓leobacteria在克隆文库中所占比例达到26%，所以此种类型的细菌是不能忽略的，即 roteobacterl是太仓4样品区别于其他三个样品所特有的。可以对样品进一步分析，确定此现象的可信程度后，可以选择其作为宅基地转化的土壤指示生物区别于其他类型的土壤。古菌的太仓2和太仓3样品差异不大，Euryarchaeota以Methanomicrobia(产甲烷菌)为主。而0℃na二haeota主要是Thermoprotei(热变形菌纲)。这与古菌在非极端环境中存在但稳定是相符的。产甲烷菌占主要是因为作物能够提供足够的能源和碳源的关系，并且p日值也在其喜好的范围内。太仓2和太仓3样品的真菌群落结构差异很大，太仓2的多样性高于太仓那个3很多，这与复垦的年数有关，大棚施用大量的化肥，一年的比五年的土壤中的各种离子差异大，所以太仓2的真菌多样性较太仓3高很多。崇明东滩湿地、水田和旱地样品量大采用了454测序的方法进行研究，太仓样品量少建克隆文库分析其多样性，两者因为数据量差异大的问题，并不能精确的说明问题，所以想要具体分析土壤发育和土壤过度利用两者对农业用地的影响，土壤质量好坏，如何更好地管理农业用地等方面还不能很好的说明。需要进一步的研究。
选取太仓4作定量分析的原因主要是其由宅基地转化而来的特殊性，与东滩湿地未发育的土壤和旱地7年的土壤进行比较希望借此作初步分析。湿地可以说是东滩的对照未开垦的，旱地7年是围垦后初期阶段的情况。太仓4种植的是辣椒，有2年的历史也属于旱地，所以将这三者进行比较分析。由表3.7可以初步推断太仓4的总细菌量比东滩样品高一个数量级，真菌量比湿地要高但比旱地7年的要差7倍左右。过度利用的太仓4土壤的细菌an7oA基因和固氮酶n归基因的拷贝数比未发育的湿地和早地要高，可能大棚使用的化肥量大对其产生的影响。菌根微生物量差异不明显。由于过度利用的土壤数据量少，在以后的实验中加大样品量才能准确的比较。由于样品和时间的有限，土壤发育和过度利用对微生物量的影响需进一步加强。