第一章 文献综述
1.皮肤衰老概述
1.1 皮肤衰老机理
随着年龄的增长，衰老是机体各项生理功能逐渐衰退的必然过程。中医学对机体的衰老提出了肾虚致衰学说、脾虚致衰学说和阴阳失调致衰学说，其中《黄帝内经》认为衰老是由脾肾两虚导致，肾乃先天之本，肾虚则表现为体衰[1]；《素问·生气通天论》中记载：“阴平阳秘，精神乃治；阴阳离决，精气乃绝”，认为阴阳失调会导致机体衰老[2]。
对于机体衰老而言，最直观的表现即为皮肤衰老。皮肤的衰老受内源性和外源性两大因素的影响[3]，内源性因素主要表现为自然衰老，随着年龄的增长，皮肤会变得松弛、干燥、缺乏弹性、产生色素沉着；外源性因素则主要表现为光老化，光老化主要由于皮肤长期暴露在紫外辐射强的环境下，引起的皮肤代谢紊乱、皮肤屏障受损，从而导致的皮肤老化[4]。
现代医学对于皮肤的衰老机制学说中受众多学者普遍认可的是自由基学说[5]。自由基学说认为，受到年龄的增长和外界环境的影响，机体的衰老过程中皮肤细胞会产生大量的自由基，而过量的自由基会损伤细胞，从而诱发皮肤的老化，而且有学者指出，自由基过多会导致机体皮肤阴阳失调，进一步加速了皮肤的老化[6,7]。因此，从这方面来说，皮肤衰老的过程就是机体内自身抗氧化系统与自由基抗衡的过程。
1.2 皮肤衰老的表现
皮肤的衰老主要表现在皮肤的外观变化、皮肤内含水量变化、皮肤组织内酶活性的改变以及皮肤组织形态学的改变。当皮肤老化时，会变得松弛、出现皱纹，甚至不规则的色素沉着。另外，衰老皮肤的含水量也会明显下降，使皮肤变得干燥、缺乏弹性，检查皮肤组织含水量是衡量皮肤衰老的一项重要指标。
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2.瓜拉纳研究进展
瓜拉纳（Paullinia cupana，Guarana）又称巴西香可可，属无患子科，是产于巴西亚马逊盆地的热带植物。作为巴西常用植物，瓜拉纳被应用于医疗保健、食品工业、化妆品等领域，并拥有广泛的消费人群。
2.1 瓜拉纳的成分分析
瓜拉纳中主要含有生物碱、多酚、鞣酸等化学成分，并且其主要药用部位为果实和种子。瓜拉纳种子中含有多种生物碱，咖啡因、茶碱、可可碱等甲基黄嘌呤类生物碱是该植物商业价值使用的主要效应成分，其中种子咖啡因含量高达4%~8%，约为咖啡豆的 2~5 倍，咖啡因作为一种中枢神经兴奋剂，口服可以提神疲劳，但同时也具有一定成瘾性，这也使得瓜拉纳受到众多学者的关注。另外，瓜拉纳中含有少量茶碱，其药理作用是可以降低平滑肌张力，但其刺激性比咖啡因更强。
瓜拉纳种子提取物中富含多酚类化合物，其中儿茶素、表儿茶素的含量较高，而单宁主要以缩合单宁或原花青素的形式存在。儿茶素外用具有较强的抗氧化作用，能清除体内多余自由基，起到抗皮肤衰老作用。此外，从瓜拉纳提取物中还发现有机酸类成分，如咖啡酸、柠檬酸、异香草酸等；烷烯化合物，如甲氧基苯丙烯、柠檬烯和石竹烯等；烷酸类化合物，如油酸，癸烯酸等；芳环类化合物，如甲基苯，二甲基丙基苯酚等成分。
2.2 瓜拉纳的主要药理作用
2.2.1 抗氧化作用
瓜拉纳提取物中含有抗氧化活性成分，如咖啡因、儿茶素等。Adriana Basile 等[12]将乙醇作为溶剂提取了瓜拉纳种子粉末，通过柠檬酸铁铵测定诱导细胞损伤后 3T3-L1 细胞中丙二醛（MDA）的浓度，发现当瓜拉纳提取物浓度为 2 μg/mL 时脂质过氧化产物减少率为 62.5%。Yamaguti-Sasaki E 等[13]证明了许多酚羟基儿茶素有能抑制低密度脂蛋白的氧化修饰，通过清除自由基和螯合氧化还原活性过渡金属离子进行抗氧化活动。此外，咖啡因经皮给药也具有较好的皮肤渗透性，具有良好的抗氧化性能，还能保护细胞免受紫外线辐射，延缓皮肤光老化过程[14]。
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第二章 瓜拉纳丁香精油纳米乳的处方筛选与优化
1. 试剂与仪器
1.1 试剂
纳米乳是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水在适当的配比下自发形成的一种分散体系[23]。纳米乳不仅能同时提高脂溶性药物和水溶性药物的溶解度，实现对不同极性物质的增溶作用，还能改善药物的稳定性，降低给药的刺激性，因此纳米乳适合作为复合药物的给药载体。在 GE-CO-NE 的制备过程中，处方筛选和优化是其制备的基础，本章将 GE-CO-NE 中主要药物之一的丁香精油作为油相，选用化妆品中常用的表面活性剂和助表面活性剂，采用伪三元相图法对纳米乳表面活性剂和助表面活性剂进行了筛选，并通过 DOE（Design of experiment，试验设计）全因子试验设计优化纳米乳各组分质量占比，最后通过伪三元相图确定了纳米乳的最佳载药量，得到 GE-CO-NE 的最佳处方。
Labrasol（嘉法狮贸易有限公司，批号 175008）；Plurol Oleique CC 497（嘉法狮贸易有限公司，批号 175491）；1, 2-丙二醇（西陇科学股份有限公司，批号：180427）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司，批号：200523）；正丁醇（西陇化工股份有限公司，批号 1505092）；RH 40（江苏海安石油化工厂，批号：20200715）；司盘 80（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120724）；司盘 20（上海易恩化学技术有限公司，批号：RH207147）；1, 3-丁二醇（上海凛恩科技发展有限公司，批号：107-88-0）；丁香干燥花蕾（江西江中中药饮片有限公司，批号：201015）。
1.2 仪器
BS124S 电子分析天平（北京 Sartorius 仪器系统有限公司）；ZNCL-BS 智能磁力搅拌器（西安安泰仪器科技有限公司）；EPED-ESL-10TH 实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司）；Malvern Nano-S 纳米粒度仪（英国马尔文公司）；微量移液枪（10μL、100μL、1000μL，Thermo 公司）；旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DZTW 调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）。
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2. 实验方法
2.1 瓜拉纳提取液的制备
参考Pagliarussi R S等人方法[40,41]，采用乙醇回流提取法提取瓜拉纳。称取100 g 瓜拉纳种子粗粉，加入 10 倍量 70%乙醇溶液回流提取 1 h，提取液经过滤后收集，药物滤渣再次加入 10 倍量 70%乙醇溶液回流提取 1 h，过滤后将两次提取液合并，于旋转蒸发仪中浓缩，将浓缩液定容至 500 mL，即得生药量为 0.2 g/mL的瓜拉纳提取液。
2.2 丁香精油的提取
参考高保栓等人方法[42]，采用水蒸气蒸馏法提取丁香精油。将丁香干燥花蕾用小型粉碎机粉碎成粗粉，称取丁香粗粉 200 g，加入 8 倍量水，浸泡 40 min，水蒸气蒸馏提取 6 h，出油率为 11.53%。
2.4 纳米乳的处方筛选
2.4.1 油相的选择
油相在纳米乳中不仅起到增溶药物的作用，而且对纳米乳的透皮性能具有一定的影响[43,44]。本试验中的主要药物为丁香精油和瓜拉纳乙醇提取物，而丁香精油作为一种植物精油，可直接作为纳米乳的油相，且瓜拉纳提取物能很好地溶于丁香精油中，因此，本试验拟将丁香精油作为纳米乳的油相。
2.4.2 表面活性剂的筛选
表面活性剂是纳米乳的重要组分之一，纳米乳形成稳定的分散体系往往取决于表面活性剂的性质[45]，且表面活性剂的 HLB 值与油相的 HLB 值越匹配，就越有利于纳米乳的形成[46]。由于丁香精油的 HLB 值未知，因此分别选取了化妆品中四种常用的不同 HLB 值的表面活性剂与助表面活性剂进行筛选，各表面活性剂和助表面活性剂的 HLB 值见表 2-1
表 2-1 试验中不同表面活性剂和助表面活性剂的 HLB 值
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第三章 瓜拉纳丁香精油纳米乳的理化性质和稳定性评价 ..............................2
1.试剂与仪器 ......................................2
1.1 试剂 ..........................................2
1.2 仪器 .................................2
第四章 瓜拉纳丁香精油纳米乳的体外释放和皮肤刺激性研究 ......................2
1.实验材料 ....................................2
1.1 试剂 .........................2
1.2 仪器 .............................................2
第五章 瓜拉纳丁香精油纳米乳抗皮肤衰老药效学考察 .......................2
1.实验材料 ..................................2
1.1 试剂 ......................................2
1.2 仪器 ...........................................2
第五章 瓜拉纳丁香精油纳米乳抗皮肤衰老药效学考察
1.实验材料
1.1 试剂
当皮肤衰老时，会出现皮肤内含水量降低、抗氧化酶活性降低、脂质过氧化产物增多、表皮真皮变薄、胶原纤维含量降低等现象。本章首先通过 DPPH 自由基清除试验初步考察和比较了 GE-CO-NE、GE-CO-M 、GE 和 CO 的抗氧化活性，然后通过体内注射D-半乳糖联合紫外光照射的方法建立了小鼠衰老模型[68-70]，通过肉眼观察小鼠皮肤状态，测定皮肤含水量，测定皮肤抗氧化酶活性、羟脯氨酸的含量、脂质过氧化产物的含量以及皮肤组织形态学观察，对皮肤的衰老程度进行表征，对比分析 GE-CO-NE、GE-CO-M 、GE 和 CO 经皮给药干预对衰老皮肤的影响。
GE-CO-NE（自制）；GE-CO-M（自制）；GE（自制）；CO（自制）；无水乙醇（西陇科学有限公司，批号：200523）；DPPH（上海阿拉丁生化科技有限公司，批号：D1915107）；维生素 C（大连美伦生物科技有限公司，批号：N1126A）；氯化钠（西陇科学有限公司，批号：1907172）；D-半乳糖（大连美伦生物科技有限公司，批号：M0301A）；冰醋酸（西陇科学有限公司，批号：2010111）总蛋白（TP）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、羟脯氨酸（Hyp）试剂盒均购自南京建成生物科技公司；维生素 E（大连美伦生物科技有限公司，批号：A0803A）；4%多聚甲醛（大连美伦生物科技有限公司，批号：MA0192-Dec-04F）；中性树胶（北京索莱宝科技有限公司，批号：1210E021）；石蜡（国药集团化学试剂有限公司，批号：20201119）；甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191028）；二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191025）；正丁醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20200831）；苏木素（北京索莱宝科技有限公司，批号：20200801）；伊红（北京索莱宝科技有限公司，批号：20201112）；Masson 三色染色液（北京雷根生物科技有限公司，批号：0825A20）
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全文总结
本文以瓜拉纳和丁香精油为原料药，首先采用乙醇回流提取法制备了瓜拉纳提取液，采用水蒸气蒸馏法提取得到了丁香精油。其次，将提取所得丁香精油作为油相，采用伪三元相图法筛选了纳米乳的表面活性剂和助表面活性剂；通过DOE 试验设计，以纳米乳粒径大小和 PDI 为评价指标，优化了未载药的 BCO-NE 处方；最后再次利用伪三元相图确定了纳米乳的最佳载药量，确定了 GE-CO-NE 最终处方为：RH 40（10%）、无水乙醇（5%）、丁香精油（1%）、瓜拉纳提取液（10%），余量为水。
通过优化的纳米乳处方制备了未载药的 BCO-NE 和载药的 GE-CO-NE，对BCO-NE 与 GE-CO-NE 的进行了理化性质考察和比较，并考察了 GE-CO-NE 的稳定性。从外观上看，BCO-NE 为无色澄清透明的液体，加入瓜拉纳提取液得到的 GE-CO-NE 则为棕红色澄清透明液体，且为 O/W 型纳米乳；从 pH 和粘度上看，药物的加入使纳米乳的 p H 略微降低，粘度略微增大，但均符合其弱酸性和低粘度的要求；从粒径分布、PDI 和 Zeta 电位上看，BCO-NE 和 GE-CO-NE 粒径均符合纳米乳（1 ~ 100 nm）的标准，且 PDI 均小于 0.3 说明纳米乳体系有较好的分散度，瓜拉纳提取液的加入使纳米乳的粒径大小和 Zeta 电位的绝对值有略微增大，但差异性不明显，说明纳米乳载药并未对其粒径分布和 Zeta 电位产生明显影响。在稳定性试验中，GE-CO-NE 在经历离心、冻融循环、加热-冷却循环及不同温度下长期储存后均未出现分层、破乳等不稳定现象，其粒径大小和PDI 均能保持相对稳定，表明 GE-CO-NE 具有良好的动力学和热力学稳定性，并具有一定期限的存储能力。
本文将 GE-CO-NE 中的主要效应成分儿茶素、咖啡因和丁香酚作为指标成分，通过完整的 HPLC 含量测定分析方法，分别考察了指标成分在 GE-CO-NE及其普通混合液 GE-CO-M 中的经皮渗透性能。结果显示，GE-CO-NE 和 GE-CO-M 中儿茶素、咖啡因和丁香酚的透皮释放均符合 Higuchi 方程，均具有缓释作用，但 GE-CO-NE 中三种指标成分的渗透速率、累积渗透量和皮肤滞留量均大于 GE-CO-M，表明纳米乳作为给药载体能提升药物的经皮渗透性能。
参考文献（略）