第一章 免疫检查点分子在艾滋病发病进程中的研究进展
1.1 常见的免疫检查点分子及其基本功能
1.1.1 程序性死亡受体（PD-1）
PD-1 在 T 细胞杂交瘤细胞株进行活化诱导的细胞程序性死亡过程中被发现[4]，其属于 B7-CD28 家族成员之一。PD-1 又称 CD289，是表达在 T 细胞表面的一种重要的免疫抑制跨膜蛋白。PD-1 有两个配体，即 PD-L1 和 PD-L2。相对于PD-L2，PD-L1 的表达分布更为广泛，主要在造血和非造血细胞中，由一些促炎细胞因子，包括 I 型 II 型干扰素、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）诱导表达。这两个配体与 PD-1 的结合会导致 PD-1 胞内结构域的酪氨酸磷酸化，继而招募酪氨酸磷酸酶（Src homology 2 domaincontaining tyrosine phosphatase，SHP-2），从而减少 T 细胞受体（T cell receptor，TCR）信号通路的磷酸化，降低了 TCR 信号通路下游的激活信号，以及 T 细胞激活和细胞因子的生成[5]（图 1.2）。PD-1 与其配体结合后，传导的负性共刺激信号能抑制 T 淋巴细胞增殖，在调节 T 细胞活化和免疫耐受过程中发挥关键作用，对防止自身免疫病的发生、发展起重要作用。
图 1.2 PD-1 的信号途径
1.2 免疫检查点分子在免疫治疗中发挥重要作用
免疫检查点分子是表达于免疫细胞上，调节免疫激活程度的刹车分子，其功能正常使得免疫系统功能保持在正常范围。如果免疫检查点功能异常，如过度表达或功能过强时，将导致免疫功能受到抑制，机体的免疫力下降，从而引发疾病。近年来免疫检查点靶向治疗在癌症方面的成就使靶向这些途径的研究再次兴起。在多种感染性疾病中，特别是持续感性疾病中免疫检查点分子均有上调，一方面其能避免感染导致的免疫过激反应对宿主的损伤，另一方面免疫检查点能够抑制宿主的免疫反应。由于免疫检查点分子在感染性疾病中的双刃剑的作用，靶向免疫检查点的免疫治疗在感染性疾病中的应用尚有争议。近年来有研究指出，共抑制性免疫检查点是导致机体发生免疫抑制的重要组成部分，它与共刺激性免疫检查点共同组成了免疫系统的调节网络，对维持机体自身的免疫耐受以及防止过度的炎症反应具有重要意义[15]。其中 CTLA-4 和 PD-1 是免疫调节系统中作用最大、研究范围最广的共抑制性免疫检查点受体，甚至临床上已经批准使用相关免疫抑制剂进行癌症的治疗[16]。研究发现，共抑制性免疫检查点受体 CTLA-4 和 PD-1和艾滋病疾病的进程紧密相关。
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第二章 CTLA-4 与中国猕猴艾滋病发病进程的关系
2.1 研究背景
动物模型是研究人逆转录病毒感染和研发治疗预防策略的重要工具[57, 58]。非人灵长类动物猕猴全基因组水平与人类相似度高达 93%，且其遗传背景、免疫系统和生理解剖结构等与人类极为相似。猴科猕猴属的猕猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）和平顶猴（Macaca nemestrina）是目前 AIDS 动物模型中应用较为广泛的灵长类动物[59]。目前，SIV/SHIV 猕猴模型是最常用的AIDS 动物模型[60]。SIV 感染的猕猴，在病毒感染途径、复制特征、致病机制、发病进程和治疗效果等各个方面与 HIV-1 感染人类均具有高度的相似性，其作为主要的艾滋病动物模型已被广泛用于 HIV 研究的多个方面。SIV 毒株如 mac239、mac251、SHIV89.6、SHIVsf162P3 等均可感染猕猴[61]。在非人灵长类中，印度猕猴（India rhesus monkeys，IRMs）和中国猕猴（Chinese rhesus monkeys，CRMs）属于相同的种，但是 CRMs 感染 SIV 后 setpoint 时血浆病毒载量较低，CD4/CD8比率较高、SIVmac 特异的抗体反应较强、AIDS 疾病进程缓慢以及动物存活周期较长等特征与未治疗的 HIV-1 感染病人更为相似[62]。因此，与 SIV 感染的 IRMs相比，SIV 感染的 CRMs 更适合用于 HIV-1 致病机制的研究。长期 HARRT 治疗后，SIV 感染的猕猴艾滋病动物模型显现出与 HIV-1/AIDS 治疗相同的效果，且病毒潜伏特征和 HIV 高度相似，因而，可以很大程度上模拟艾滋病的疾病进程[63, 64]。因此，深入探究 SIV 的致病机制能够加深我们对 HIV-1 致病机制的了解，进而促进 HIV-1 治疗策略的制定和疫苗的研究与开发。
CTLA-4 是主要的免疫负调控分子，在免疫缺陷中起重要作用。Leng 等报道，在 HIV 阳性个体中，CTLA-4 在 CD4+ T 细胞中的表达比率显著高于 HIV 阴性个体，而且其与 HIV 疾病阶段密切相关[65]。在 SIV 感染的猕猴动物模型中 CTLA-4的表达是否同 HIV-1 感染的人类一致，CTLA-4 的表达与 SIV 感染的中国猕猴艾滋病疾病进程之间的关系如何，本研究对此进行了探索。
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2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
12 只青年雄性中国猕猴购自中国科学院昆明动物研究所灵长类研究中心，于 ABSL-3 中适应饲养后，感染 SIVmac39。SIVmac239 感染猴经中国科学院昆明动物研究所动物护理机构委员会批准研究（批准号：IACUC18010）。实验动物信息见表 2.1。
表 2.1 实验动物基本信息
2.2.2 病毒
采用 SIVmac239 慢性感染期中国猕猴 PBMC 与 6 只正常猕猴的 PBMC 进行混合培养[66]，收集培养后 7-8 天的病毒上清并分装，获得原代病毒，该病毒用作接种病毒。Reed-Muench 法测定病毒半数组织培养感染剂量（median tissue culture infective dose，TCID50），测定病毒滴度时用 CEMⅹ174 细胞。
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第三章 ROS 对 T 细胞中 CTLA-4 表达的影响 ...........................29
3.1 研究背景 ................................... 29
3.2 实验材料 ................................... 32
第四章 cA MP-PKA 通路对 CTLA-4 表达的可能调控 ........................ 43
4.1 研究背景 ...................................... 43
4.2 实验材料 ................................ 44
全文总结 .................................... 61
第四章 cAMP-PKA 通路对 CTLA-4 表达的可能调控
4.1 研究背景
CTLA-4 是 T 细胞活化的负调控分子，主要表达于活化的 T 细胞表面。CTLA-4 和 T 细胞表面的 CD28 分子具有高度的同源性，但 CTLA-4 较 CD28 具有更强的亲和力与 CD80 或 CD86 分子结合，从而阻断共刺激信号，进而导致细胞周期和 IL-2 的产生受到抑制[83]。抗体对 CTLA-4 的阻滞作用阻止了诱导性cA MP 和 cGMP 反应元件的积累，使得 IL-2 的表达抑制得以缓解[84, 85]，cA MP对 T 细胞的增殖和 IL-2 的产生具有类似的抑制作用[86, 87]。
cA MP 为第二信使的信号通路，主要是通过 cA MP 激活的蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）使下游靶蛋白磷酸化所介导的[87]。细胞内 cA MP 由两类腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）产生，一种是跨膜 AC（TmAC），另一种则是可溶性 AC（sAC）。TmAC 和 sAC 都可以在刺激下将 ATP 转换为 cAMP。当 G蛋白偶联的膜受体接收到细胞外信号时，TmAC 可以被 G 蛋白激活。胞内 cA MP浓度的升高导致 PKA 的活化。无活性的 PKA 是由 2 个调节亚基（R）和 2 个催化亚基（C）组成的四聚体，在每个 R 亚基上有 2 个 cA MP 的结合位点，cA MP与 R 亚基结合是以协同方式发生的，即第一个 cAMP 的结合会降低第二个 cA MP结合的解离常数，因此，细胞内 cA MP 水平发生很小的变化就能导致 PKA 释放C 亚基并快速使激酶活化，这是细胞快速应答胞外信号的过程。此外，还有一类细胞缓慢应答胞外信号的过程，即 cA MP 信号通路对细胞基因表达的影响，主要表现为活化后的 PKA（催化亚基）入核，使基因调控蛋白（cA MP 应答结合蛋白，CREB）磷酸化，磷酸化的基因调控蛋白与靶基因调控序列结合，从而增强靶基因的表达。磷酸二酯酶（PDE）是通过将 cAMP 水解为 AMP 来终止cA MP-PKA 信号的负调节剂。cA MP 水平和信号活性由 AC 和 PDE 之间的平衡决定的。除了其主要效应子 PKA 之外，cA MP 还可以直接激活交换蛋白 Epac，环核苷酸门控通道（CNGC）和含 Popeye 域的蛋白（Popdcs）。在单个 cA MP 级联中，AC、PKA 与其他下游效应子以及 PDE 通常由不同亚细胞位置的 A 激酶锚定蛋白（AKAP）束缚在一起[88]。
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全文总结
艾滋病（AIDS）是一种由艾滋病病毒（HIV）侵入人体后，破坏人体免疫功能，使人体产生多种无法治愈的感染性疾病和肿瘤，最终导致被感染者死亡的一种严重传染病。HIV 是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的 CD4+ T 淋巴细胞作为主要攻击目标，通过大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能。CTLA-4 作为免疫负调控分子在体内主要参与细胞免疫应答，而细胞免疫在控制 HIV-1 的复制中起着重要作用。Kaufmann 等研究表明，CTLA-4在 HIV 阳性的人群 CD4+ T 细胞中高表达[16]，但 CTLA-4 在 HIV-1 感染的人体中表达上调的机制仍不清楚。为了阐明免疫检查点分子 CTLA-4 表达上调的机制，本研究以应用较为广泛的猕猴艾滋病动物模型为基础，探究免疫负调控分子CTLA-4 与艾滋病疾病进程的关系及其调控机制。
首先，建立 SIVmac239 感染的猕猴艾滋病动物模型，对不同时间点猕猴血液样本进行采集。流式检测感染前后 CTLA-4 表达水平，发现 CTLA-4 在 SIV 感染的猕猴 CD4+ T 中也具有高表达现象，这与 HIV 感染的人群结果一致。究其原因，HIV 感染人体后，病毒在体内不断复制，过量的 HIV 攻击人的 CD4+ T 淋巴细胞使人体免疫系统遭到破坏，此外，HIV-1/SIV 感染导致细胞活化和增殖指标升高。进一步分析 CTLA-4 在 T 细胞中的比率与以上指标之间的关联性，结果显示，SIV 感染急性期，血浆病毒载量升高，CTLA-4 的表达也显著上调；SIV 感染慢性期，血浆病毒载量相对急性期显著下降，CTLA-4 表达水平与急性期相比也显著下调，分析 CTLA-4 表达水平和病毒载相关性，结果显示 CTLA-4 表达水平与病毒载量呈显著正相关。这提示我们，CTLA-4 表达的上调由病毒载量的升高引起。进一步分析了 CTLA-4 的表达比率与免疫学指标、细胞增殖活化之间的关联性。结果显示，CTLA-4 在 CD4+ T 细胞中的表达与 CD4+ T 细胞数量呈显著负相关，与 CD8+ T 细胞数量呈显著正相关，与 CD4/CD8 比值呈显著负相关；分析 CTLA-4 在 CD4+T 细胞中的表达与细胞的增殖和活化之间的关联性，结果显示，CTLA-4 在 CD4+ T 细胞中的表达与细胞的增殖和活化均呈显著正相关。然而，CTLA-4 在 CD8+ T 细胞中的表达与以上指标之间的关联性不显著。综上所述，在 SIV 感染的中国猕猴艾滋病动物模型中，CTLA-4 在 CD4+ T 细胞中的表达显著上调，且 CTLA-4 在 CD4+ T 细胞中表达的上调是因为病毒载量的变化而引起，且与病毒载量呈显著正相关。
参考文献（略）