本文是一篇医学论文，本研究从探索 DLBCL 不良预后的分子标志物出发，从参与了其他肿瘤多个作用机制的 IQGAP 家族入手，以在线分析结果为线索，初步发现：与大多数其他癌症细胞系相比，IQGAP2 mRNA 在血液系统恶性肿瘤细胞系中的表达更高；而这一特殊现象并不存在于 IQGAP1 和 IQGAP3。
第一章 IQGAP2 在 DLBCL 中的表达情况研究
第一节 IQGAP2 在 DLBCL 中的表达情况研究1 材料与方法
1.1 材料
关于癌细胞系中 mRNA 表达的数据可从癌细胞系百科全书（Cancer Cell LineEncyclopedia，CCLE，https://portals.broadinstitute.org/ccle)下载。该公共数据库含有来自 33 个原发疾病的 1377 个细胞系的转录表达数据，其中包含 DLBCL、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、慢性髓系白血病、B 细胞急性淋巴细胞白血病、T 细胞急性淋巴细胞白血病等血液系统肿瘤的细胞系，还包含胃癌、肝细胞癌、胶质瘤、肾细胞癌等实体肿瘤。
GSE10846 和 GSE11318 数据集从基因表达综合数据库（Gene ExpressionOmnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载，包括系列矩阵文件和GPL570。GSE11318 是回顾性数据集，包括 74 个 ABC、71 个 GCB、31 个原发纵隔大 B 细胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL）和 27 个 UC 临床样本。GSE10846 也是回顾性数据集，包括 167 个 ABC、183 个 GCB 和 64 个UC 临床样本。GSE72056 也是从 GEO 数据库下载。单细胞 RNA 测序（RNA-seq）应用于从 19 例黑色素瘤患者分离的 4645 个单细胞。所有细胞分为黑色素瘤细胞、T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、内皮细胞、癌相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAF）和 NK 细胞。
淋巴瘤组织的免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色数据从人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas，https://www.proteinatlas.org/）下载，该网站将淋巴瘤 IQGAP2 的 IHC 染色分为强染色（high staining）、中等程度染色(mediumstaining) 、 低 染 (low staining) 和 未 检 测 到 (not detected) 这 四 个 等 级 。 其 中 用HPA037404 抗体染色的标本有 19 个，用 CAB004241 抗体染色的标本有 16 个。代表性图片被用于展示。
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2 结果
2.1 IQGAP2 mR NA 主要在血液肿瘤细胞中表达
既往研究提示，IQGAP 家族参与了多种恶性肿瘤的多个生物学过程。在这里，我们首先对 IQGAP 家族蛋白在不同肿瘤细胞系中的表达情况进行分析。结果表明，与胶质瘤、肺癌和肾癌细胞系相比，肝癌细胞系的 IQGAP2 mRNA 表达水平更高（图 1.A 和 B），这与先前的报道一致[14]。其次，微阵列和 RNA 测序结果均显示IQGAP2 mRNA 主要在恶性血液细胞中表达（图 1.A 和 B）。然而，与其他癌细胞相比，血液系统恶性肿瘤细胞的 IQGAP1 mRNA 和 IQGAP3 mRNA 表达并不算高（图 2.A-D）。另外，黑色素瘤的单细胞测序结果显示，T 细胞、巨噬细胞和 NK细胞表达的 IQGAP2 mRNA 水平明显高于黑色素瘤细胞（补充图 2.A、B）。这些结果提示，IQGAP2 很可能在血液肿瘤细胞中相对高表达，他在血液肿瘤中的作用可能不同于在其他肿瘤细胞中的作用，而且 IQGAP 家族的 IQGAP1 和 IQGAP3 可能并不具备这些特点。所以，我们初步将 IQGAP2 在 DLBCL 中的临床意义和作用机制作为我们的研究对象。
2.2 预后较差的 DLBCL 亚组中 IQGAP2 表达更多
GCB DLBCL 患者的生存率高于非 GCB DLBCL 患者（包括 ABC 和 UC）[7,9]。我们的结果显示，来自 GCB DLBCL 的样本表达的 IQGAP2 mRNA 低于 ABCDLBCL（图 4.A 和 B）。这表明 IQGAP2 mRNA 与 DLBCL 的恶性程度有关。在蛋白质水平上，高级别淋巴瘤比低级别淋巴瘤表达更多 IQGAP2（图 4.C-L）。这些结果表明，传统的病理亚型间 IQGAP2 的表达水平并不相同，预后差的亚型或病理级别与 IQGAP2 的相对高水平相关。因此，这也提示 IQGAP2 很可能在 DLBCL中起到促进肿瘤的作用。
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第二章 IQGAP2 mRNA 表达水平与 DLBCL 患者生存期呈负相关
第一节 IQGAP2 MRNA 表达水平与 DLBCL 患者生存期呈负相关
1 材料与方法
1.1 材料
GSE10846 和 GSE11318 数据集从基因表达综合数据库（Gene ExpressionOmnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载，包括系列矩阵文件和GPL570。GSE10846 也是回顾性数据集，包括来自 CHOP 治疗患者的 181 份临床样本和来自 R-CHOP 治疗患者的 233 份临床样本，同样记录了生存信息及性别、年龄、病理亚型、ECOG 分期、AAS 分级、LDH 浓度结外病灶数量和高通量转录组数据。GSE11318 是回顾性数据集，记录了 200 名患者的生存信息及性别、年龄、病理亚型、治疗方案、ECOG 分期、AAS 分级、LDH 浓度结外病灶数量以及高通量转录组数据，但是治疗方案仅有 CHOP 方案或者未知方案，结外病灶数量仅有 0、1 或未知数量。因此，对于 GSE11318 是回顾性数据集，其生存分析没有 R-CHOP组别、结外病灶数量>1 组别。
1.2 方法
生存分析在 GraphPad Prism 8.01 中采用 log-rank（Mantel-Cox）检验。根据IQGAP2 的 mRNA 表达水平将 DLBCL 患者分为高表达组和低表达组。R 软件中的Coxph 算法被用于进行多变量 Cox 回归分析。P<0.05 被认为具有统计学意义。
本研 究还 通过 TIMER 网 站(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在 线评估 了IQGAP2 与肝细胞癌和肾透明细胞癌患者生存率的相关性，这个网站是一个用于系统分析各种癌症类型的综合资源。
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2 结果
2.1 IQGAP2 mR NA 表达水平与 DLBCL 患者总生存期呈负相关
生存分析表明，在 GSE10846 和 GSE11318 数据集中，DLBCL 患者中 IQGAP2mRNA 高表达组比 IQGAP2 mRNA 低表达组生存时间更短（图 5.A 和 B）。考虑到治疗对生存率的影响，我们对采用相同化疗方案的患者进行了生存分析。我们发现，当分别使用 CHOP 和 R-CHOP 治疗时，IQGAP2 mRNA 水平高的患者的生存时间仍然较短（图 5.C-E）。另外，根据 TCGA 数据，IQGAP2 mRNA 水平高的肝癌和肾癌患者存活时间更长（图 7.A 和 B）。
2.2 IQGAP2 mR NA 表达水平与不同亚组的 DLBCL 患者总生存期呈负相关
国际预后指数（international prognostic index，IPI）是公认的对 DLBCL 患者进行预后分层的评分体系。它包括年龄、Ann Arbor 分级（Ann Arbor stage，AAS）、血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）浓度、根据东部肿瘤合作小组的表现状态（performance status according to the Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）分期以及淋巴结外疾病部位的数量。考虑到这些混杂因素对 DLBCL 患者生存期的影响，我们对患者亚组进行了分层生存分析（图 5.F-L 和图 6.A-L）。高IQGAP2 mRNA 水平患者的总生存时间总是短于低表达组，其中，仅图 5.F 和图6.F 的 p 值未能达到 0.05，其余生存分析均有显著差异（p<0.05）。而且，这两个 p值未能达到 0.05 的生存期曲线也有明显趋势，若能扩大样本量，则很可能使得差异具有显著性。
医学论文参考
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第三章 IQGAP2 可能与 DLBCL 的免疫抑制相关..................... 16
第一节 IQGAP2 可能与 DLBCL 的免疫抑制相关........................ 16
1 材料与方法.......................... 16
2 结果.............................. 17
3 讨论................................ 18
4 小结.......................................... 19
全文总结........................................... 20
第三章 IQGAP2 可能与 DLBCL 的免疫抑制相关
第一节 IQGAP2 可能与 DLBCL 的免疫抑制相关
生物过程（biological process，BP）富集分析：在 RStudio 1.1.453 中计算 IQGAP2和所有其他基因之间的皮尔逊相关系数（r 值）。r>0.4 的基因被定义为 IQGAP2 相关基因。IQGAP2 相关基因的 BP 分析在注释、可视化和综合发现数据库（TheDatabase for Annotation, Visualization and Integrated Discovery，DAVID）v6.8 中进行。折线图、柱形图是在 Excel 2016 中生成的。
免疫相关基因 IQGAP2 mRNA 和 mRNA 的热图：各种 mRNA 表达文件被上传至（https://software.broadinstitute.org/morpheus/）Morpheus 网站进行热图可视化。所有表达数据的 Z 分数（减去平均值，除以标准偏差）被计算出来后通过热图显示。根据 IQGAP2 表达对所有样本进行分类。最后这些热图是从 Morpheus 网站上下载的。
白细胞浸润：Yoshihara 等人开发了在肿瘤中通过表达数据评估基质和免疫细胞的算法（ The Estimate of Stromal and Immune Cells in Malignant Tumors fromExpression Data，ESTIMATE），以评估浸润性非肿瘤细胞的数量和肿瘤纯度[23]。通过估算 RNA 转录物的相对亚群来鉴定细胞类型（Cell-type Identification ByEstimating Relative Subsets Of RNA Transcripts ， CIBERSORT ，https://cibersort.stanford.edu/)算法，也称为电子流式细胞术[24]，用于评估白细胞浸润的百分比。这些计算结果均上传至 Morpheus 网站来进行热图可视化。所有样本均根据其 IQGAP2 表达进行分类。
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全文总结
本研究从探索 DLBCL 不良预后的分子标志物出发，从参与了其他肿瘤多个作用机制的 IQGAP 家族入手，以在线分析结果为线索，初步发现：与大多数其他癌症细胞系相比，IQGAP2 mRNA 在血液系统恶性肿瘤细胞系中的表达更高；而这一特殊现象并不存在于 IQGAP1 和 IQGAP3。我们进一步在蛋白水平确定了IQGAP2 在淋巴瘤中有表达；而且在预后不良的病理亚型和病理等级中 IQGAP2水平更高。因此，我们将 IQGAP2 在 DLBCL 中的预后意义和可能的分子作用机制作为我们的研究目标。
第二章中，我们利用 2 个超过百例且含有详细临床资料的 DLBCL 公共数据集，分析了 IQGAP2 mRNA 表达水平与 DLBCL 患者总生存期之间的关系，阐明了高表达 IQGAP2 的 DLBCL 组织对应了较差的总生存期；考虑到治疗方案和其他公认的预后影响因素这些混杂因素的影响，我们将数据进行分层，分层后的生存分析也总是提示高表达 IQGAP2 的 DLBCL 组织对应了较差的总生存期；我们还用多因素 COX 回归分析进一步说明了，IQGAP2 mRNA 是 DLBCL 不良预后的影响因素，且独立于治疗方案、年龄、ECOG 分期、AAS 分级、结外病灶数、LDH 浓度这些寄望明确的预后影响因素。
第三章中，我们以生物信息学的方法，对 IQGAP2 相关 mRNA 进行功能富集分析，结果提示 IQGAP2 很可能与 DLBCL 的肿瘤免疫抑制有关；对高通量转录数据进行肿瘤纯度和白细胞种类分析，结果显示 IQGAP2 表达水平与非肿瘤细胞的浸润程度相关，特别是 CD8 T 细胞、CD4 记忆激活 T 细胞和γδT 细胞，但是这些抗肿瘤的免疫细胞似乎没有起到抗肿瘤作用。
本研究从 DLBCL 不良预后的分子标志物这一临床问题入手，第一次阐明IQGAP2 表达水平是 DLBCL 患者不良预后的独立影响因素，并且深入探讨了IQGAP2 很可能参与了 DLBCL 的肿瘤免疫抑制过程，为进一步分子机制研究和潜在的治疗靶点提供了思路。
参考文献（略）