本文是一篇医学论文，本论文对于 CTCs 检测过程中的实时电学信号变化进行了检测与分析，以简便可行的方式实现了在生物传感中实时检测的目的。这种对于 CTCs 实时检测取得的成功，增强了我们进一步研究的信心。
第 1 章 绪论
1.1 前言
癌症的诊断与治疗一直以来都是人们重点研究和急需攻克的难题，研究者也一直在寻找新的方法以实现对癌症问题的进一步探索。循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell) 的概念由澳大利亚籍医生 Ashworth 在 1869 年首次提出后，为癌症的诊疗提供了新的研究方向。自此，研究者越来越重视对循环肿瘤细胞的研究。同时，对于能够捕获和传感循环肿瘤细胞的生物传感器也备受研究者的青睐。随着近些年纳米科学技术的崛起，利用纳米技术来研究和解决生物学问题越来越普遍，纳米技术在生物传感器上的应用也使得对循环肿瘤细胞的捕获与传感更加高效。
石墨烯作为一种由单层碳原子以 sp2 杂化轨道堆积成的二维原子晶体，以高的化学稳定性、常温下高于碳纳米管的电子迁移率、良好的生物相容性、大的比表面积和极强的力学性能等优点，在科学研究上受到了广泛关注。石墨烯的这些电学及物理化学等特性在提高生物传感器的灵敏度及信号强度等方面具有重要意义，使得石墨烯成为构建生物传感器的重要生物材料。除了石墨烯，许多纳米材料由于具有优越的光、声、电、热、磁等特性也为生物传感器的构建注入了新的活力。特别是金属氧化物纳米材料，作为纳米科学技术及半导体材料的研究热点，被广泛用于生物传感器的构建。合理的金属氧化物纳米结构与石墨烯组成的纳米复合材料能够表现出良好的导电性和生物分子吸附能力，在构建生物传感器中能够有效提高电化学分析的灵敏性和传感的稳定性。尤其是氧化锌 (ZnO) 纳米材料所表现出的良好电学性能、光学性能、生物相容性、易于制备等优点，其与石墨烯组成的石墨烯/ZnO 纳米复合材料在生物传感中的应用能够取得良好的效果。
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1.2 生物传感器
1.2.1 生物传感器概述
生物传感器是一种能够对生物物质敏感，并将获取到的浓度等信息转换为电信号进行检测的分析装置，通常是在明确特定目标分析物的情况下对样品进行分析[1]。一个生物传感器主要是由结合了生物材料或生物衍生材料的生物元件（分子识别元件），一个物理化学换能器或传感器（信号转换元件），和信号处理系统构成的[2, 3]。图 1.1 是生物传感器原理示意图，生物传感器中的识别元件被固定在传感器表面，当加入样品时它能够与目标分子相互作用（特异性结合），之后通过信号转换器件转变为可被检测的信号（电信号、光信号等）。通常分子识别单元包括酶、核酸、细胞、生物组织、抗体、抗原等[4, 5]；物理化学转换类型可分为光学型、热学型、电磁型、电化学型、机械型等，因此通常的信号转换元件包括光学元件、热敏元件、电极、压电晶体等[6-10]。针对不同的待测物质，可以利用分子识别元件与信号转换元件的合理搭配来自由组建生物传感器。生物传感器具有轻巧、简便、灵敏、准确等优点，相较于通常分析技术的步骤繁琐、耗时耗力、价格昂贵等诸多因素，生物传感器在医药、生物医学、生命科学、食品环境等领域的应用越来越受到研究者的青睐[11, 12]。
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第 2 章 石墨烯三维检测基底的制备与表征
2.1 前言
构建合理的生物基底对循环肿瘤细胞进行捕获已经成为癌症检测中的常用且有效的手段。研究学者们在面向生物检测基底的构建方面，已经向操作简便、价格低廉、生物相容性好、特异性强和捕获效率高等方向发展，生物检测基底的结构也已经从最初的二维检测界面发展成了三维检测基底。随着纳米技术的崛起和新材料的发现，越来越多的合理有效的纳米复合基底被用来高效捕获 CTCs。除了单纯的对 CTCs 的捕获，近年来研究学者们也在 CTCs 被捕获后的传感方面进行了大量研究，这使得对于 CTCs 的检测基底有了更高的要求。因此用于捕获 CTCs 的生物基底在满足高效捕获细胞的同时还应该具有较强的电子传输能力，并且基底于 CTCs 之间的结合也要求更加稳固。研究学者们通过构建有较强的电子传输能力的检测基底在 CTCs 被捕获后的传感方面取得了一定的进展，其中对于捕获 CTCs 过程中的实时传感还需进一步研究。为了实现对捕获 CTCs 过程中的实时传感研究，这就需要更加合理的生物检测基底。
本章节中，我们设计了一种可用于捕获 CTCs 过程中实时传感的三维大孔径石墨烯检测基底。由于石墨烯具有较强的电子传输能力，因此我们采用石墨烯为检测基底的主体架构。首先利用纯石墨制备了氧化石墨烯 (GO)，并且采用模板法将 GO 塑造成三维泡沫结构。随后使用一水合肼将 GO 泡沫结构还原成还原的石墨烯 (rGO) 泡沫结构，并去除模板。以氧化锌纳米粒子为种子，采用水热法在 rGO 泡沫结构中石墨烯的表面生长 ZnO 纳米棒阵列。在检测基底捕获 CTCs 的过程中想要更好的进行传感研究，则需要 rGO- ZnO 泡沫结构与 CTCs 有更好的结合能力，因此我们对 ZnO 纳米棒进行表面修饰。ZnO 纳米棒表面存在大量羟基，可以与 3-巯基丙基三甲氧基硅烷很好的结合。之后通过偶联剂 (马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 (GMBS, 98%) 和链霉亲和素 (SA)) 与 3-巯基丙基三甲氧基硅烷的偶联作用，在氧化锌表面修饰了特异性上皮细胞抗体 (anti-EpCAM)。anti-EpCAM 抗体分子可以有效且稳固的与 EpCAM 阳性的人类乳腺癌细胞 (MCF-7 细胞) 进行结合，这对于捕获 CTCs 过程中的实时传感是至关重要的。
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2.2 实验试剂与仪器
本实验中所用到的实验试剂及购买厂商如下： 我们从 Sigma-Aldrich 公司购得石墨和一水合肼 (N2H4·H2O, 98%)。乙醇(C2H5OH, 99.7%)、二甲基亚砜 (DMSO, 99.9%)、氯化铁 (FeCl3, 98%) 和盐酸(HCl, 36-38%) 从均采购于北京化工厂。从天津华东试剂厂购买了环六亚甲基四胺 (HMTA, 99%) 和 Zn(NO3)2 (99%)。去离子水是从 PINGCHENG 科技有限公司获得的，3-巯基丙基三甲氧基硅烷 (95%) 和马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 (GMBS, 98%) 都购自 J&K 化工有限公司。链霉亲和素 (SA, 1 mg/mL)、抗体 (100 μg, 0.5 mg/mL)、细胞培养基 (DMEM, 1X, 4.5 g/L 葡萄糖、谷氨酰胺，110 mg/L 丙酮酸钠)、胎牛血清 (FBS)、青霉素链霉素 (10 mg/mL 链霉素和 10000 Units/mL 青霉素)、4’、6-二氨基-2-苯吲哚 (DAPI) 以及胰蛋白酶 (1X) 均购买自 Merck KgaA 公司。
检测仪器及检测方式如下：
我们采用场发射扫描电子显微镜 (SEM, JEOL JSM-7500F) 对三维大孔泡沫、ZnO纳米棒和基底固定化后的细胞形貌进行了表征。我们采用 514 nm 激发波长的共聚焦拉曼分光光度计 (BWTEK) 对还原氧化石墨烯的还原程度进行了研究。我们采用Rigaku RU-200b X 射线粉末衍射仪 (XRD)，在 10o≤2θ≤70o 范围内，用 Cu 辐射 (λ = 0.15405 nm) 对所制备的 rGO-ZnO 泡沫进行了测定。MCF-7 细胞的荧光图像由荧光显微镜 (Olympus IX 71) 获得。
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第 3 章 循环肿瘤细胞的捕获与传感 .............................. 34
3.1 前言 .................................................. 34
3.2 循环肿瘤细胞的培养 ...................................... 34
第 4 章 结论与展望 ................................... 49
4.1 结论 ....................................... 49
4.2 展望............................................. 50
第 3 章 循环肿瘤细胞的捕获与传感
3.1 前言
在上一章节中我们构建了用于检测 CTCs 的三维生物基底，计划利用石墨烯的高效电子传输能力实现 CTCs 与检测基底结合过程中的实时检测。在本章中我们主要研究了这种检测基底对CTCs 的灵敏检测。我们从荧光显镜照片中可以直接观察到 MCF-7 能够被基底高效捕获，并用 SEM 来进一步观测检测基底对 MCF-7 的捕获状态。为了更好的利用三维生物检测基底进行 CTCs 传感，我们提供了两种检测模式，分别用于检测 CTCs 传感过程中的电阻和阻抗。我们准备了 5000 cells/mL 的 MCF-7 细胞和 Hela 细胞, 1000 cells/mL 和 500 cells/mL MCF-7 细胞，在不同细胞悬浮液下进行 I-V 响应测试。我们利用 I-V 响应曲线计算出在细胞贴附过程中检测基底的实时电阻变化，并进行相互比较。通过对比，我们发现 MCF-7 细胞与检测基底的结合会导致检测基底电阻发生变化，并且随着时间的推移和 MCF-7 浓度的增加这一电阻变化趋势越发明显。我们利用 500 cells/mL 的 MCF-7 细胞进行阻抗传感测试，发现与纯细胞培养基相比，有 MCF-7 细胞参与的 EIS 曲线低频部分的斜率和高频部分半圆形区域都发生了明显变化。之后我们利用 ZsimDemo 软件对得到的 EIS 曲线进行拟合，并比较了不同条件下的 Rct 的变化，也通过拟合电路对 CTCs 的检测原理进行了分析。
医学论文参考
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第 4 章 结论与展望
4.1 结论
癌症的诊断与治疗一直时人们关注和研究的热点，对于肿瘤细胞的检测也越来越受到研究者的重视。随着近些年纳米科学技术的崛起，新型纳米生物材料得到迅猛发展，这为生物传感领域提供了新的助力。在本论文中，我们开发了一种 3D 石墨烯大孔复合结构 (rGO-ZnO-antiEpCAM泡沫)，这种结构不仅用于循环肿瘤细胞的高效捕获，更实现了对循环肿瘤细胞附着基底过程中的实时传感研究。我们以石墨烯为原材料采用两步氧化法制备了氧化石墨烯，并采用 Pacholski 法合成的 ZnO 纳米粒子。我们采用模板法制备了具有自支撑结构石墨烯基底，并在其表面生长了 ZnO 纳米棒。ZnO 纳米棒阵列增加了 rGO 与细胞之间的接触，并且因在其表面生长了细胞粘附分子 (anti-EpCAM) 而达到对 MCF-7 细胞特异性识别的目的。我们通过 Raman 光谱验证了 GO 还原成了rGO；利用 SEM 观察到 ZnO 纳米棒紧密且均匀的生长在 rGO 表面。我们通过荧光显微镜观察到循环肿瘤细胞被 rG O-ZnO-antiEpCAM 泡沫结构高效的捕获，并且通过 SEM 观察到了 MCF-7 细胞的伪足与检测基底表面的 ZnO 纳米棒紧密连接。在不同的细胞悬浮液下，rG O-ZnO-antiEpCAM 泡沫的电学性能呈现规律性变化。相同浓度的 MCF-7 细 胞 比 HeL a 细 胞 更 能 使 检 测 基 底 的 电 阻 明 显 增 加 ， 这 是 由 于 antiE pC AM 阳性的 MCF-7 细胞能够更好的与基底结合。相较于没有抗体的检测基底，在相同浓度 MCF-7 细胞作用下，有抗体的检测基底电阻增加明显，这是由于没有 antiE pC AM 时 MCF-7 细胞不能有效的与基底紧密的结合。在高浓度 MCF-7 细胞的作用下检测基底的电阻变化显著增大，这可能是由于带负电荷的 MCF-7 细胞与 rG O-ZnO-antiEpCAM 泡沫结合后逐渐影响了 p 型 rG O 的电导率。我们在研究了检测基底的电阻变化规律之后，还对检测基底进行了 EIS 测量。在 EIS 中，我们发现在 MCF-7 被捕获过程中 EIS 曲线高频部分的半圆区域半径逐渐变大，EIS 曲线低频部分的斜率也呈现变大的趋势。EIS 曲线高频部分的半圆区域半径的变大这说明检测基底的 Rct 逐渐增加，并且通过拟合电路得到 Rct 的具体数值，证明了有 MCF-7 细胞作用时 Rct 增加明显。Rct 的增加是由于带负电荷的 MCF-7 固定在衬底上，阻碍了电荷转移过程。
参考文献（略）