第 1 章 综述
1.1 具核梭杆菌的生物学特性
1.1.1 具核梭杆菌的分型
具核梭杆菌属于梭杆菌属，是一种形状呈梭形的革兰氏阴性无孢专性厌氧菌。最早由 Veillon 和 Zuber 对其进行了纯化及命名。而后 Dzink 等人通过其生物学特征将其分为三个亚种：具核亚种、多形亚种、文森亚种。
1.1.2 具核梭杆菌的定植及传播
粘附和侵入是定植、传播、逃避宿主免疫及诱导宿主反应的重要机制。具核梭杆菌是定植于口腔的一种粘附细菌。它与口腔中的各种微生物聚集在一起形成生物膜，在牙菌斑的形成中起着关键作用[17]。具核梭杆菌编码的粘附素包括 Fap2、RadD 和 Aid1，这些粘附素是与其他各种微生物间共聚集的关键[18, 19]。具核梭杆菌还具有和多种哺乳动物细胞结合的能力，如：上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞、红细胞、成纤维细胞、HeLa 细胞和 NK 细胞等，此外具核梭杆菌还能与宿主的一些生物分子结合，如唾液大分子、细胞外基质蛋白、人 IgG 和钙粘蛋白等[20, 21]。Han YW 等人通过体外实验证实具核梭杆菌能够在体外侵入上皮细胞和内皮细胞，并且在小鼠胎盘的血管内皮细胞内观察到具核梭杆菌的侵入[22, 23]。
粘附素 FadA 是具核梭杆菌最具特征的毒力因子[20]，它有两种存在形式，即 Pre-FadA和 mFadA，两者形成具有活性的复合体，参与与宿主细胞的结合和侵入[24-26]。RubinsteinMR 等人在一项研究中发现，从正常人结肠组织到腺瘤组织和癌组织 FadA 基因水平依次逐渐升高。并且与正常对照组相比，邻近腺瘤和癌的正常组织中的 FadA 水平也升高，这表明具核梭杆菌存在场效应[24]。另一方面，FadA 不仅是一种粘附素，同时也是一种侵袭素，它在具核梭杆菌结合侵袭正常细胞和癌细胞以及定植于小鼠胎盘过程中发挥重要作用[20, 22-24, 27]，FadA 能与细胞连接分子钙粘蛋白、内皮细胞上的 VE 钙粘蛋白以及上皮细胞和结直肠癌细胞上的 E 钙粘蛋白相结合[24, 27]。由于钙粘蛋白广泛存在于各种组织和细胞中，因此具核梭杆菌能够在体内许多部位定植。具核梭杆菌在一些解剖部位定植以后，往往能够侵入组织细胞间隙甚至细胞内。FadA 与内皮细胞上的 VE 钙粘蛋白结合，使其从细胞-细胞连接处迁移到细胞内，增加了内皮细胞的通透性。因此，FadA 通过细胞-细胞连接直接侵入宿主细胞及细胞周围。这可能是具核梭杆菌在体内传播的机制[27]。FadA 使内皮细胞通透性增加的同时也使得其他细菌更容易侵入，这也是具核梭杆菌感染时常合并其他细菌感染的原因[28]。FadA 由两个密切相关的物种具核梭杆菌和牙周梭杆菌独特编码，而在大多数其他梭杆菌属中不存在[29]，因此，FadA 是一种潜在的诊断标志物，可用于具核梭杆菌和牙周梭杆菌的特异性检测。
...........................
1.2具核梭杆菌与感染性疾病的关系
尽管具核梭杆菌与口腔微生物群的其他成员有着互利共生关系，并且是健康人口腔生物膜的重要组成成分，但是无论是口腔内还是口腔外，它在一定情况下对于人体也可以是具有致病性的。例如其在牙周炎的发生发展过程中发挥重要作用，它能直接影响宿主反应，并且增加其他病原体的传染性。其作用机制为具核梭杆菌可诱导人β-防御素 2 和促炎细胞因子（包括 IL-6 和 IL-8）在口腔上皮中的表达[23, 30, 31]。并且这种由具核梭杆菌所引起的炎症在口腔肿瘤的发生发展中也发挥重要作用[34]。在致病因素存在下，具核梭杆菌也能影响免疫细胞的功能，激活 NF-κB，从而导致 TNF 的产生[30]。牙周炎是一种由多种细菌引起的疾病，了解具核梭杆菌如何与其他口腔微生物相互作用来驱动疾病是至关重要的。与单纯具核梭杆菌感染相比，具核梭杆菌和牙龈假单胞菌联合感染巨噬细胞可以抑制炎性小体的激活[35]。除此之外，具核梭杆菌还增加了牙龈假单胞菌的侵袭潜能[36, 37]，这表明这些细菌协同作用可以逃避免疫系统的破坏，并在牙周炎期间形成一个易感的环境。
具核梭杆菌引起口腔外疾病的机制现在仍不明确。尽管从各种疾病的临床标本中都分离出了具核梭杆菌（阑尾炎[9]、脑脓肿[10]、骨髓炎[11]、心包炎[12]等），但具核梭杆菌在这些疾病中的作用仍不清楚。有学者认为，在这些疾病中，具核梭杆菌只是疾病引起的一个变化，而不是一个致病因素[38]。具核梭杆菌在胎盘感染和早产中的研究较多，并且大多数研究结果表明具核梭杆菌是疾病的病原体或驱动因素。具核梭杆菌是从早产羊水中分离出来的最常见的微生物，可以侵入人脐带的血管内皮细胞中[22]。此外，使用小鼠模型的临床前研究已经证明，当静脉注射具核梭杆菌后，具核梭杆菌可以定植于胎盘并引起小鼠死胎[22]。基于以上研究，似乎能够说明具核梭杆菌就是一种胎盘病原体，不过从另一方面看，具核梭杆菌也可能是健康胎盘微生物群的一部分[39]。就像口腔中的具核梭杆一样，其只有在一些特定条件下才具有致病性并引起疾病。此外，由于在研究中研究者们更注重异常胎盘的检查，可能会存在取样偏差，从而得出在患病胎盘和羊水中具核梭杆菌的检出率更高的结论。
..........................
第 2 章 头颈部鳞状细胞癌差异化基因及通路生物信息分析
2.1 材料与方法
本次分析的数据库来源于 TCGA 数据库（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图集），TCGA 数据库是由美国国家癌症研究所国家人类基因组研究所合作建立的，共纳入了超过 2 万种原发性肿瘤，共有超过 2.5PB 的基因组、表观基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，并且这些数据对研究者们是开放的。
我们在 TCGA 数据库选择与头颈部鳞状细胞癌相关的关键词，检索相关实验数据，下载基因表达文件及数据注释文件，将基因表达数据用 Perl 整理成基因表达矩阵，在本次分析中，使用基于经验贝叶斯分布的线性模型计算显著差异性水平 P-value，并使用 Benjamini-Hochberg 法对显著差异水平进行校正。显著性差异基因的筛选标准为：|Fold Change|≥2.0 且 P<0.05。
为进一步了解在正常组织和头颈鳞癌中存在显著性差异的基因所代表的生物功能及其在生物过程所处的位置，将在头颈鳞癌中上调的基因和下调的基因分别做 GO 分析和 KEGG 通路分析。
GO 数据库（Gene Ontology，基因本体)将基因功能分成三个部分：细胞组分（cellular component, CC）、分子功能（molecular function, MF）、生物过程（biologicalprocess, BP）。利用 GO 数据库，我们将对头颈部鳞癌中筛选出的差异基因在 CC, MF和 BP 三个层面上进行分析，进一步了解在正常组织和头颈鳞癌中存在显著性差异的基因所代表的生物功能及其在生物过程所处的位置。
KEGG 数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书），除了对基因本身功能的注释，基因会参与人体的各个通路，基于人体通路而形成的数据库就是通路相关的数据库。KEGG 就是通路相关的数据库的一种。通路数据库有很多，类似于 wikipathway，reactome 都是相关的通路数据库。本研究对头颈部鳞癌中筛选出的差异基因进行 KEGG 通路分析，以寻找差异基因所富集的通路。
..........................
2.2结果
2.2.1 差异基因的筛选
在 TCGA 数据库中共检索到 545 条相关实验数据，其中包括 501 条头颈部鳞癌表达数据，44 条正常组织表达数据，采用两组样本间的基因表达差异倍数和显著性检验得到的 P 值两个因素共同绘制火山图并进行层次聚类分析（图 3.1），显示两组样本数据的显著性差异。差异分析显示，共有 9031 个基因在两组间表达存在差异。其中，上调的有 5619 个，下调的有 3412 个。差异性最显著的 10 个上调基因为 COLGALT1、HOXC-AS2、FOXD2-AS1、CDCA5、C5orf34-AS1、EME1、GPRIN1、AC114956.1、MYBL2、KIF2C。差异性最显著的 10 个下调基因为 CST2、PM20D1、CA6、PRH1、CST4、LCN1、KRT35、KLK1、THRSP、PRR27。
医学论文参考
..............................
第 3 章 头颈部鳞状细胞癌差异化基因及通路生物信息分析........................9
3.1 材料与方法.................................... 9
3.2 结果.......................................... 10
第 4 章 喉癌及下咽癌中具核梭杆菌的相对定量分析................................14
4.1 材料与方法................................. 14
4.1.1 病例资料......................................14
4.1.2 标本采集........................................14
第 5 章 讨论..................30
第 5 章 讨论
生物信息学是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学的问题。随着测序技术的发展，已经有海量数据不断被纳入各种公开数据库中，其中TCGA 数据库数据涉及到各种癌症基因的 mR NA/microR NA 表达谱、拷贝数变异、突变等大量的生物信息学数据。
本研究应用 TCGA 数据库对头颈部鳞状细胞癌进行生信分析，通过对显著差异基因进行 KEGG 分析及 GO 分析，我们发现在头颈部鳞癌的差异基因所富集的通路包括：ECM−受体的相互作用、中性粒细胞和细胞外陷阱的形成、人乳头瘤病毒感染、细胞因子−细胞因子受体的相互作用、PI3K−Akt 信号通路、NK 细胞介导细胞毒性、JAK−STAT 信号通路、癌症中的转录调控失调等，这些富集的通路与炎症反应相关。差异基因所富集的生物过程包括：补体激活（经典途径）、由循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应、B 细胞介导的免疫、免疫球蛋白介导的免疫反应、体液免疫反应、淋巴细胞介导的免疫力、基于免疫球蛋白超家族结构域构建的免疫受体躯体重组的适应性免疫反应等，这提示头颈部鳞癌差异基因的富集可能与炎症与机体免疫等生物过程关系较为密切。头颈部鳞癌的差异基因筛选显示，其中存在多个 E-cadherin 家族分子（CDH）和 WNT 家族分子表达显著上调。这与具核梭杆菌的致病机制相类似，具核梭杆菌能够分泌毒力因子 Fad A 粘附素，促进与宿主细胞的结合和侵入，从而与钙黏蛋白结合引起β-连环蛋白激活及 WNT 通路激活促进肠道肿瘤的发生发展[22-24]，提示具核梭杆菌可能与头颈部鳞癌存在一定关联。
医学论文怎么写
...........................
第 6 章 结论
1、通过对 TCGA 数据库进行生物信息学分析筛选出差异基因，对差异基因进行 GO分析及 KEGG 分析发现，在头颈部鳞癌中炎症及免疫相关生物过程及通路显著富集，提示头颈部鳞癌可能与微生物感染相关。
2、在喉癌及下咽癌组织中，具核梭杆菌丰度较配对癌旁组织及正常组织升高。
3、喉癌及下咽癌组织中具核梭杆菌丰度与性别、年龄、烟酒史、淋巴结转移及 TNM分期无相关性。
4、在喉癌及下咽癌患者粪便中，具核梭杆菌丰度与正常组相比无统计学差异。
参考文献（略）