第 1 章 绪论
1.1 研究背景
1.1.1 口腔癌
口腔癌是一种非常常见的恶性肿瘤，其中，以鳞状上皮细胞癌最为多见。根据 GLOBOCAN 在 2012 年做的统计，口腔鳞癌的全球发病率为 6/100,000 [1]。导致口腔癌的危险因素有很多，比如烟草、酒精、人类乳头状病毒以及紫外线暴露等。由烟草和酒精导致的口腔癌，多见于 60-70 岁人群。由人类乳头状病毒感染导致的口腔癌，多发于年轻人群，且男性的发病率要高于女性[2]。口腔癌的治疗方法包括外科切除、放射疗法、化学疗法或几种疗法的结合。而具体使用哪种疗法，取决于肿瘤的位置、大小、分期，以及患者的依从性、身体状况、对侵入性治疗的耐受程度等。对于可行外科手术切除的口腔癌患者，一般首选手术治疗，但是临床上常由于患者口腔医疗意识落后等问题，导致口腔癌诊断相对较晚，大多数患者确诊时已不适合行手术治疗，通常情况下会选择放、化疗相结合的治疗方案[3]。近年来，尽管医学界在口腔癌的影像学诊断、手术技术、放化疗以及全身疗法等方面取得了长足的进步，然而，总体来看，口腔癌患者 5 年内生存率仍低于 50%，在过去的三十年里，生存率一直未能得到改善[4]。而其中最主要的原因是，用于治疗口腔癌的一线化疗药物：长春新碱、顺铂、甲氨蝶呤等，在长期使用后易使肿瘤出现耐药性，且易向邻近组织浸润甚至转移[5]。
1.1.2 肿瘤的耐药性
在药物治疗的初始阶段，大多数药物都能呈现出良好的药物反应性。但随着治疗的推进，肿瘤会在体内外各种因素的刺激下，产生对化疗药物的耐受。按照获得的时机，可以将耐药性分为两种——固有耐药性和获得耐药性[6]。固有耐药性是指肿瘤在接受化学治疗之前就具有的耐药性，而获得耐药则是在治疗之后发生的多种细胞内分子反应的结果。肿瘤细胞耐药性形成的机制非常复杂，形成固有耐药性的机制包括：1. 肿瘤细胞的固有基因突变；2. 肿瘤干细胞比例的增多；3. 生理条件下排毒通路的启动。获得耐药性形成的机制包括：1.治疗开始后癌细胞通过新的突变或表达，来增加对药物的耐药性；2. 药物靶标的改变；3. 药物在肿瘤细胞中的代谢；4. 通过 ATP 结合盒（ATP-binding cassette transporter, ABC）转运蛋白将药物从细胞内泵出；5. 表观基因组的改变；6. 肿瘤微环境随治疗改变等。这些耐药机制可以单独或联合起作用，促进癌症耐药发生[7]。以长春花生物碱和紫杉烷类药物为例，两种药物都可以靠影响微管功能抑制细胞分裂。随着治疗的进行，微管的功能和动力学逐渐发生改变。此外，细胞内的微管相关蛋白发生上调，这种蛋白可以阻止药物与微管的结合，使肿瘤细胞发生药物抵抗，影响化疗效果。因此，明确肿瘤耐药性的产生机理、逆转肿瘤耐药性，对于癌症治疗有着重要的意义。
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1.2 研究现状
化疗过程中肿瘤细胞产生的耐药性，是临床中的一大挑战。产生耐药性的肿瘤细胞，不仅对放、化疗有更强的抵抗力，其增殖、侵袭的能力也随之上升。临床上通常使用多药联用的方法，来克服细胞对于单一药物的耐药性。然而，多药耐药细胞的出现，削弱了这种策略的收益。
近年来，随着对沙利霉素研究的不断深入，研究者们发现了它的抗癌作用。与传统抗癌药物相比，沙利霉素除了具有靶向性更强、毒性更小、对癌症干细胞针对性更好的优点之外[26]，还具有削弱肿瘤对于化疗药物耐受性的功效。因此，学术界认为，沙利霉素作为单分子多靶标的抗癌化合物，与其他药物联合应用于逆转肿瘤耐药性，具有巨大的研究潜力。然而，沙利霉素对于耐药口腔鳞癌的作用还少见报道。本研究旨在研究沙利霉素对耐药口腔癌细胞的影响，通过评估沙利霉素处理前后，肿瘤细胞增殖能力、转移能力、侵袭能力、耐药性的改变，探究可能的分子机制，为沙利霉素在临床上的应用提供理论指导。
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第 2 章 实验材料
2.1仪器设备
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2.2细胞复苏
1) 将从-80℃超低温冰箱取出的细胞冻存管立即放入 37℃的水浴锅中； 2) 在超净台外用 75%酒精棉球擦拭冻存管外表面，在超净台内将冻存管内融化的细胞悬浮液转移至 15ml 离心管中，离心管内提前先加入 3~5ml 完全培养基； 3) 室温，1000r/min 离心 5 min，弃上清； 4) 用 3 ml 完全培养基吹打重悬细胞，接种于 25cm2的细胞培养瓶中； 5) 轻柔吹打以混匀细胞，放置在 37℃，5% CO2 细胞培养箱中培养； 6) 24~48h 后，根据细胞的生长状态，更换新的培养基。
ROS 是指细胞内的一系列不稳定的分子，如过氧离子、氢氧根、过氧化氢等[42]。ROS 可激活下游与细胞死亡相关的信号级联，从而调控癌细胞对放疗、化疗的反应[43]。ROS 亦可诱导癌细胞发生周期阻滞[44]、氧化应激导致的 DNA损伤甚至凋亡[45]，因此成为了肿瘤研究中的热点。而谷胱甘肽（GSH）是人体中重要的抗氧化剂，能为超氧化物歧化酶（SOD）水解氧自由基提供氢离子，从而降低细胞活性氧水平。研究使用荧光显微镜和流式细胞术评价了不同处理条件下 KB/V 细胞的 ROS 水平，来反映药物作用。荧光显微镜下观察，发现与对照组相比，SAL 能显著上调肿瘤细胞活性氧水平，而 GSH 能够逆转这种上调作用。流式细胞术的定量检测也揭示了同样的结果（图 5）。结合 CCK-8 实验，我们使用 VCR 单独作用于 KB/V 细胞，可见相比对照组，细胞生存率发生下降。当VCR 和 SAL 联用时，细胞生存率进一步下降。然而，当我们使用 GSH 降低细胞活性氧水平之后，可观察到肿瘤细胞的存活率也随之提高（图 6）。这证明，SAL 可通过上调活性氧水平来发挥逆转 KB/V 对 VCR 耐药性的作用。
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第 3 章 实验方法 .................... 8
3.1 细胞培养 ................................... 8
3.2 细胞复苏 ................................ 8
3.3 细胞传代 ................................... 8
第 4 章 结果 ................................ 15
4.1 沙利霉素增强长春新碱对人口腔癌耐药细胞 KB/V 的细胞毒性作用 .................................... 15
4.2 沙利霉素对 KB/V 细胞侵袭和迁移的影响 ........................ 15
4.3 沙利霉素能够削弱长春新碱对 KB/V 细胞 G2/M 期阻滞作用 ..................17
第 5 章 讨论 .................... 22
第 4 章 结果
4.1 沙利霉素增强长春新碱对人口腔癌耐药细胞 KB/V 的细胞毒性作用
通过 CCK-8 细胞增殖实验检测 VCR 对 KB/V 细胞的生长抑制作用以及 SAL与 VCR 序贯合用对 KB/V 细胞的生长抑制作用，结果显示：VCR 单独作用组当VCR 的浓度达到 200nM 时细胞生存率与未加药对照组显示出显著差异而 VCR与 SAL 合用组在 VCR 浓度为 2n M 时即与对照组显示出显著差异（图 1）。对比VCR 浓度为 400nM 时两组的细胞生存率， VCR 单独作用组的生存率为75.25±1.99 而 VCR 与 SAL 合用组的生存率显著低于 VCR 单独作用组仅为28.57±0.97。（Mean±SD）
医学论文参考
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第 5 章 讨论
长春新碱（VCR）是一种来自长春花的植物提取物，由于其能作用于肿瘤细胞微管，阻止细胞有丝分裂，被广泛应用于治疗多种癌症[27, 28]。然而，尽管长春新碱的抗肿瘤作用在实验室中被反复验证，但具体的化疗效果却常常受到肿瘤的获得性耐药以及患者复发等因素的限制。当肿瘤耐药发生时，提高长春新碱用药浓度，可能会诱发严重的胃肠道中毒症状[29]。因此，临床上治疗口腔癌时，常将 VCR 与其他药物或生物活性材料联用，以针对产生了单一耐药性的肿瘤细胞。但是，这种方法对于具有多药耐药性的肿瘤，效果欠佳。在对抗肿瘤药物的探索中，一些药物被证明可以逆转肿瘤耐药性，增加肿瘤对放疗和化疗的敏感性。使用这些药物作为化疗辅助用药，能显著改善肿瘤预后。
沙利霉素（SAL）是一种羧基聚醚类钾离子载体抗生素，曾广泛用于畜牧业。近年的研究证实，SAL 对乳腺癌[14, 30]、前列腺癌[31]、结直肠癌[32]、肝癌[33]都有良好的抑制作用。SAL 可以通过抑制 P-gp 蛋白活性的方式，逆转人白血病干细胞的多药耐药性[34]。然而，SAL 对于耐药口腔癌细胞的影响还未见报道。因此，本研究提出假设：SAL 可逆转口腔癌的耐药性，并探寻可能的相关分子机制，为临床用药提供理论指导。
本研究使用 VCR 单独作用于耐药细胞系 KB/V 细胞，CCK-8 评价细胞生存率（图 1），当 VCR 浓度在 1-100nM 范围内时，对肿瘤细胞的存活无显著影响。当 VCR 浓度大于等于 200nM 时，KB/V 细胞存活率出现下降。当使用 SAL 进行提前孵育时，2nM 的 VCR 即可引起 KB/V 存活率的下调，且当 VCR 浓度达到 200nM 时，近半数的肿瘤细胞死亡。这证明了 SAL 能够提高耐药口腔癌对于VCR 的敏感性。
长期使用抗有丝分裂的药物，会促使肿瘤细胞发生 G2/M 期阻滞，或是导致非整倍体细胞的形成。研究证实 G2/M 期细胞和非整倍体细胞具有抗凋亡的能力，这也是抗有丝分裂药物治疗癌症易发生耐药性的重要原因之一[41]。长春新碱是一种典型的抗有丝分裂药物，能够抑制微管蛋白聚合，阻止纺锤丝的形成，进而使肿瘤细胞停滞在 G2/M 期。本研究使用流式细胞术分析 KB/V 细胞的细胞周期，发现在 VCR 单独孵育组中，G2/M 期细胞比例明显上升。SAL 与VCR 联用时，G2/M 期细胞的比例发生了 SAL 浓度依赖式下降(图 4)。
参考文献（略）