第 1 章 实验研究
1.1 材料与方法
1.1.1 主要实验材料
1）实验药品与试剂及耗材
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1.2 结果
1.2.1 实验小鼠术后饲养及基因型鉴定结果
实验进程中，对实验小鼠的实验操作程序均符合华北理工大学动物中心操作规范，所有操作过程顺利，小鼠于麻醉过程未出现意外状况发生。造模小鼠术后运动和饮食稍微变慢，但总体姿势大体正常。无小鼠出现撕咬伤口以及后期感染情况。小鼠皮肤伤口较小，5 天左右即完全愈合。造模操作结束后所有小鼠进食、水正常。实验期间未因生长环境或手术操作不当出现小鼠的非正常死亡。实验共有 20 只小鼠纳入实验。
凝胶成像得出基因型结果如图 1 所示：OCN-Cre 和 STAT3fl/fl 的成像结果，Cre+，STAT3fl/+和 Cre-，STAT3 fl/+代表 WT 小鼠，Cre+，STAT3fl/fl 代表 KO 小鼠的基因型鉴定结果。KO 小鼠基因型为：OCN-Cre+，STAT3fl/fl。
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第 2 章 综述
2.1 OA 中的 TGF-β 及其信号传导通路
TGF-β 是一种多功能的多肽类细胞因子，参与细胞的增殖、生长、分化、凋亡，以及细胞外基质合成、免疫调节和组织修复等过程。TGF-β 在哺乳动物体内发现 3种，分别为 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β 受体(TGF-β receptor, TβR)是跨膜复合体，分为 I、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型受体（TβRⅠ）和Ⅱ型受体（TβRⅡ）具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。TGF-β1 结合 TβR 的亲和力是 TGF-β2 的 10~80 倍，因此哺乳动物体内起主导作用的是 TGF-β1[107]。一般情况下组织细胞产生的 TGF-β 均处于无活性状态，但当处于酸性环境下如创伤后和感染等，TGF-β1 在基质金属蛋白酶、整合素、纤溶酶等作用下转化为活性状态。
TGF-βRI 有七个亚型，称为激活素受体样激酶 1-7（activin receptor-like kinase，ALK）。生理情况下，在大多数细胞类型中，TGF-β 通过与 TGF-βRII 和 ALK5 的结合发出信号而激活整个通路发挥效应。研究发现 TGF-β 主要通过经典 Smads 信号通路和非经典 Smads 通路如 Ras-MAPK、p38 蛋白和 PI3K/Akt 信号通路途径进行信号转导。经典 TGF-β1/Smad 信号通路途径：激活后的 TGF-β 与 TβRⅡ结合，再招募TβRⅠ形成异聚复合物，然后激活下游 Smad 2、3 或 1、5、8，磷酸化的 R-Smad 与Smad4 结合形成 Smad 复合物转运入细胞核内与 DNA 结合，调节靶基因的转录。ALK1 激活 Smad1/5/8 的磷酸化，刺激 MMP-13 的表达而 ALK5 激活 Smad2/3 的磷酸化，刺激基质丝氨酸蛋白酶（HtrA1）的表达。小鼠膝关节中，低剂量 TGF-β1 的注射会增加关节软骨的蛋白聚糖含量，但是，TGF-β1 在膝关节中的过表达会导致 OA样变化，包括滑膜和骨赘增生。在 OA 中，一方面 TGF-β 信号调节细胞外基质蛋白的合成和降解，控制软骨细胞的增殖和分化，抑制其肥大和成熟。但同时 TGF-β 也可诱导滑膜纤维化[101]，其下游因子 MMP13 和 HtrA1 是降解细胞外基质蛋白关键降解酶，在关节软骨退变过程中起着关键作用。软骨下骨中成骨细胞产生的高浓度TGF-β1 直接导致软骨下间充质干细胞迁移和过度成骨分化，促进软骨下骨重塑和硬化，导致软骨应力分布不均，导致 OA 的发生；滑膜细胞通过激活 TGF-β 信号通路发生增殖迁移以及产生细胞外基质。
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2.2 TGF-β 信号通路抑制药物对 OA 软骨保护作用
TGF-β 信号与软骨细胞的分化密切相关，与 OA 的发生发展也紧密相连。TGF-β信号通路对正常软骨细胞稳态有重要作用，但过量的 TGF-β 会导致 OA 相关的软骨破坏。抑制软骨细胞中 TGF-β 信号通路的药物研究包括减少 TGF-β 产生，阻止 TGF-β 与受体结合和阻扰受体激酶信号的传递这几个方面。因此根据影响信号通路的不同层次的药物可分为以下几类抑制剂。
2.2.1 TGF-β 天然抑制剂阻止 TGF-β 与受体结合
Decorin 是一种分布于哺乳动物的细胞外基质中的富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，也是 TGF-β 天然抑制剂。研究证明，Decorin 的核心蛋白能与 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 分别结合形成相应复合物，从而干扰 TGF-β 与相应受体结合启动 TGF-β 信号通路达到抗纤维化的作用[108]。Qing Li 等给 3 月龄 Decorin 缺失和 Decorin 基因敲除小鼠采用内侧半月板失稳（DMM）手术方法诱导 PTOA 模型实验中，研究发现Decorin 基因敲除小鼠与对照组相比，软骨表面形成胶原纤维和骨赘，并且基质中的硫酸化氨基多糖（sGAG）的丢失增多。而 Wayne 等实验研究表明，在肾小球肾炎模型小鼠中注射人重组 Decorin 和牛血清提取的 Decorin 可抑制肾小球的纤维化水平，是通过抑制 TGF-β 过度表达导致的细胞外基质的沉积，并通过体外水貂肺上皮细胞实验中，发现重组人 Decorin 阻断水貂肺上皮细胞中 TGF-β3 种亚型的生长抑制作用[109]。因此可见 Decorin 可延缓软骨表面的胶原和纤维的丢失，从而在软骨退变中起到保护作用；同时，Decorin 也可作为抑制生物体内 TGF-β 过度表达的潜在有效治疗药物。通过以上研究，天然抑制剂 Decorin 通过阻止 TGF-β 与受体结合而影响该通路参与 OA 的病理生理过程。
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第 2 章 综述 ........................................... 32
2.1 OA 中的 TGF-β 及其信号传导通路 ................................ 32
2.2 TGF-β 信号通路抑制药物对 OA 软骨保护作用......................................... 33
2.2.1 TGF-β 天然抑制剂阻止 TGF-β 与受体结合 ..................................... 33
2.2.2 阻扰受体激酶信号的传递药物 ........................................ 34
2.4 TGF-β 信号通路抑制药物对 OA 滑膜的保护作用
OA 滑膜的特征是滑膜出现炎症和纤维化。滑膜细胞通过激活 TGF-β 信号通路发生增殖迁移以及产生细胞外基质[127-129]。滑膜细胞产生的透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种由膜结合的透明质酸合成酶（hyaluronic acid synthase，HAS）合成的糖胺聚糖，而产生的蛋白多糖-4（proteoglycan-4，PRG4）是一种高度糖基化的粘液糖蛋白。HA 和 PRG4 在关节润滑中起重要作用，也可能在关节纤维化中发挥作用。在滑膜细胞中，TGF-β1 诱导细胞增殖和 I 型胶原积聚为特征的纤维化改变。TGF-β1 也会刺激滑膜细胞中胶原蛋白 I（collagen I，COL1A1），α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA），金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases ，TIMP）-1 和胶原蛋白赖氨酸，2-氧戊二酸 5-双加氧酶 2（2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）的表达。此外，TGF-β1 促进 OA 滑膜细胞分化以 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）为为特征的肌成纤维细胞样表型。肌成纤维细胞具有增强产生胶原、增殖和迁移的能力[130-134]。
腺苷-3′，5′-环磷酸腺苷（adenosine-3′,5′-cyclic adenosine phosphate ，cA MP）是腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）在激活后产生的多效性细胞内第二信使 [135-139]。AC 激活剂 forskolin 对 TGF-β1 刺激的 OA 滑膜细胞模型中 α-SMA 和 I 型胶原、TIMP-1、PLOD2、HAS 亚型和 PRG4 的表达以及 HA 和 PRG4 的表达产生影响[140-145]。Forskolin 直接与 AC 结合并从 ATP 生成 cA MP，cA MP 的增加导致蛋白激酶 A（PKA）依赖性和非依赖性途径的激活。在生长因子的存在下，forskolin 激活 cA MP依赖性 PKA，PKA 激活的 CREB 与 TGF-β1 刺激的 SMAD 介导的转录辅因子竞争，阻断 TGF-β1 诱导的下游信号通路。研究结果证实 Forskolin 治疗可增加细胞内 cA MP，细胞渗透 cAMP 类似物处理后可降低 TGF-β1 刺激的 OA 滑膜细胞 ACTA2 和 COL1A1的表达，并且增强 HA 和 PRG4 的分泌。因此 Forskolin 可降低 TGF-β1 诱导的 OA 滑膜细胞增殖和迁移以及 OA 滑膜细胞肌成纤维细胞样表型。但目前 cA MP 和 TGF-β1之间机制尚不清楚[146-149]。
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2.5 结语与展望
OA 作为第四大慢性致残性疾病，目前针对 OA 发病机制的药物比较少。由于TGF-β 信号通路在早期软骨、软骨下骨以及滑膜发育和维持稳态中起着关键作用，并 TGF-β 信号通路在 OA 进展中起到重要作用，表明 TGF-β 信号通路抑制剂是治疗OA 的合适分子靶点。因此减少 TGF-β 产生和阻断 TGF-β 信号通路药物可阻断 OA的进展，使 OA 从根本上得到改善。此类药有治疗骨关节炎患者的潜在可能。然而，具有抑制 OA 潜能的各项抑制剂，大多证明可以减轻 OA 进展，但目前各药物的副作用及生物利用度是否适用于人类还未知，缺乏临床试验，需要进一步探索。
参考文献（略）