前 言
口腔过敏综合征(Oral allergy syndrome,OAS)是临床上的常见病,是指以食物过敏原为主引起的由免疫球蛋白 E(Immunoglobulin E,IgE)介导的过敏反应性疾病[1-2]。该综合征通常突发或口腔黏膜一旦与生、鲜食物接触后会即时发生,时间持续数分钟至数小时[3],发生部位通常局限在与食物接触的口腔黏膜[4]。OAS 临床上表现通常为嘴唇或口咽、舌的麻木瘙痒或水肿,喉咙发痒,上腭或牙龈瘙痒、刺痛和脸部红疹,有时可能发生全身症状,如荨麻疹,过敏性鼻炎,结膜炎,哮喘发作,胃肠道症状如疼痛,恶心,呕吐和腹泻也可能发生[5],在罕见的情况下,喉部水肿可能会引起呼吸困难,甚至窒息因此称之为口腔过敏综合征[6]。1940 年代 Tuft 等人第一次报道了过敏性鼻炎和口腔食物过敏(Oral food allergy,FA) 的关系[7],指出有环境过敏史(花粉症)患者在吃生水果后口腔黏膜瘙痒、肿胀过敏反应。1987 年 Amlot 等人在一项比较特异反应性患者的研究中,描述了食物过敏(Food allergy,FA)患者的口腔过敏,偶尔会蔓延到全身的症状,并首次提出“口腔过敏综合征”这个术语[8]。以往文献报道,大约 20%~80%的 OAS 患者与季节性过敏性鼻炎有关[9],暗示植物性食物的某些抗原和吸入性过敏原(花粉)在结构上有相似性[10]。它包括蛋白质氨基酸结构的相似性和序列的相似性。对某些种类的食物蛋白而言,氨基酸序列上的相似性不高,但其三维结构和总构象的相似性非常高[11]。所以,即使有些人对某些种类的水果、蔬菜和坚果食物不过敏,也可能出现 OAS。有报道称,非植物性食物如牛奶、鸡蛋、海鲜,不会引起 OAS。煮熟的食物如鸟肉,鸡肉,猪肉,意大利腊肠以及螨过敏原引起的 OAS 过敏,在没有花粉过敏史的情况下,这些病例不应列入 OAS 范畴[12]。为了避免这种特殊的食物过敏综合症与花粉过敏原无关的食物过敏混淆,OAS 以往也被称为花粉-食物过敏综合征(Pollen-foodallergy syndrome,PFS)[13]。
口腔作为人体消化系统的起始部分,其本身具有强大的免疫屏障功能,由于机体口腔组织特异性黏膜屏障和非特异性系统自我保护和调节作用,可以限制完整的蛋白质抗原侵入,所以,一般情况下人体对口腔摄入的食物蛋白不产生过敏反应。但是,有些食物可以作为攻击抗原[14],活跃在口腔引起口腔过敏,有时食物抗原甚至进入胃肠道引起过敏性肠炎。根据免疫机制的不同,食物过敏可以归为三类:IgE 介导型、非 IgE介导型以及 IgE 和非 IgE共同介导的混合型过敏反应[15]。大量的研究已经证明,IgE 介导的发病机制包括肥大细胞和嗜碱粒细胞与 IgE 结合交联和炎性介质的即时释放的效应阶段和由于 T 细胞、嗜碱性粒细胞参与的慢性过敏性炎症[16]。目前大多数学者认为,OAS 的免疫学基础 IgE 介导识别特定抗原的超敏反应[17]。IgE 介导的对食物抗原的高反应性,早期轻则表现为荨麻疹,口腔过敏综合征、过敏性肠炎、皮肤红疹,重则为威胁生命的过敏性休克[18]。尽管食物过敏的死亡率较为罕见,但初步估算每年死亡率约为 1.8/1000, 000[19]。OAS 在儿童中较少见,但患病率随着年龄的增长而增加,OAS 是青少年和成人食物过敏最常见的表现形式[5]。目前,严格回避接触过敏原预防 OAS 这一方法依然很难实现[20]。对食物过敏意外的恐惧及饮食回避严重影响着人们的生活质量[21-23]。另外,临床工作中我们注意到,接触抗原后诱发的 OAS往往能够自我平息,对于这种在急性过敏反应中参与自我限制和调控的发病机制仍不清楚[24]。虽然近年来关于过敏反应免疫的研究进展迅速,但由于人体免疫系统的复杂多变性、食物交叉反应的多样性和 OAS 过敏发生时间的不确定性,人们对 OAS 的许多方面仍知之甚少。那么,探索建立一种可复制、稳定性好的小鼠 OAS 模型,将为该领域带来更深入的了解。研究过敏性疾病动物实验模型方法一直是国内外学者研究的重点。目前,相当成熟的动物模型已经有很多如过敏性哮喘,过敏性鼻炎、过敏性肠炎、过敏性眼结膜炎[25-28]等。然而,目前并没有针对 OAS 模型的实验研究以及规范化的统一标准要求,对于制备口腔过敏动物模型所使用的动物、方法、过敏原信息等所知相对较少。由于体内实验可以全面而客观地反映过敏反应的发生,BALB/c 小鼠被广泛用来评估食物蛋白抗原致敏潜力[29-30]。为此,我们拟使用花生抗原建立口腔过敏综合征小鼠模型,并对该模型进行深入评价和探讨,以便后续降低过敏原风险以及免疫治疗开发的研究,为更好地防治 OAS 奠定一定的理论基础和实验依据,同时对于解决可能因食物过敏引起的口腔健康问题,保障并提高人民的生活质量也具有重要意义。
..........
1 材料与方法
1.1 主要实验试剂的配制
(1)红细胞裂解液:NH4Cl 4.15g,ddH2O 定容至 500mL,调 pH = 7.4。常温保存备用。(2)1%盐酸乙醇分色液:5 mL 浓盐酸溶于 495 mL 75%乙醇,充分混匀。(3)0.1%氨水返蓝液:400 mL 去离子水加入 400 μL 氨水。(4)1%甲苯胺蓝原液:取 1.0 g Toluidine Blue(Sigma T0394)溶于 100 mL 70%乙醇溶液,溶解后再加入 0.5 mL 浓盐酸,并在使用前过滤。(5)完全培养基:45 mL RPMI 1640 + 5 mL 胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)+ 500 μL 双抗(含有青霉素和链霉素),现配现用。(6)10%过硫酸铵(AP):称量 0.1g APS 粉末,溶于 1mL ddH2O,4℃贮存(1周内使用)。(7)5 ×SDS-PAGE 缓冲液:(pH = 6.8)1M Tris-HCl 2.5 mL,SDS 粉末 1g,溴酚蓝粉末 50 mg,丙三醇 2.5 ml,将以上溶液配定容至 10 mL,室温保存备用,使用前加入 0.5% β-巯基乙醇。(8)考马斯亮蓝 R-250 染色液:R-250 粉末 1g,异丙醇 250mL 搅拌溶解,冰乙酸 100 ml,搅拌均匀,最后定容至 1L。用滤纸过滤除杂,常温放置。(9)考马斯亮蓝脱色液:冰醋酸 100ml,无水乙醇 50ml,去离子水 740ml,混匀充分,室温保存。(10)SDS-PAGE 蛋白凝胶配方:浓度 12%,总体积 5 mL 分离胶: H2O 1.6mL,10% SDS 0.05mL,(PH = 8.8)1.5M Tris-HCL 1.3mL,10%过硫酸胺(AP) 0.05mL,TEMED 0.002mL,30%丙烯酰胺 2.0 mL;浓度 5%、总体积 2mL 浓缩胶:H2O 0.68mL,1.5M Tris-HCL(PH = 6.8) 0.13mL,10% SDS 0.01mL,10%过硫酸胺(AP)0.01 mL,TEMED 0.001 mL,30%丙烯酰胺 0.17 mL。(11)ELISA 实验所需碳酸盐包被液(pH = 9.6):Na2CO30.75g,NaHCO31.46g,ddH2O 450 mL,定容至 500 mL,调 pH 值 = 9.6,4 ℃冰箱保存备用;1 ×PBS:ddH2O 800 mL 溶解 KCl 0.2g,Na2HPO41.42g,KH2PO40.27g,NaCl 8.0g,充分溶解后定容至 1 L 并调节 PH 至 7.4,备用;1 ×PBST 洗涤液:取 500 μL 吐温 20 加到 1 L1 × PBS 溶液中混匀,现用现配。终止液:300 mL 去离子水,取浓度为 98%浓硫酸55.5 mL 的缓慢加入到水中,一边搅拌一边加,待温度下降后,定容至 500ml,室温保存备用。5%脱脂奶粉封闭液:2.0g 脱脂奶粉,溶于 40 mL 1 ×PBS 中。2.5%脱脂奶粉样本稀释液:1.0 g 脱脂奶粉,溶于 40 mL 1 ×PBS 中。
..........
1.2 动物实验方法
BALB/c 小鼠,雌性,6~8 周龄,体重(20.28 ±5.00)g,购买于广东省实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2013-0002。饲养于深圳大学 SPF 级实验动物房,小鼠保持在无病原体的环境中自由摄食和饮水。(1)动物分组:小鼠经适应性喂养 1 周后,根据随机分组原则将 20 只 6~8 周龄雌性 BALB/c 小鼠分为 2 组:PBS 对照组和 CPE 模型组,每组各 10 只。实验程序由深圳大学动物伦理委员会批准。按照批准的准则进行实验。(2)致敏液及激发液的配制:CPE 作为本次研究中的特定过敏原。致敏液制备是由 CPE(含 CPE 100 μg)和霍乱毒素(CT)的比例以 10: 1(W/W)混合而成;激发液终浓度为 10 mg/mL。(3)基础致敏:小鼠乙醚轻度麻醉后,将由 CPE 和 CT 混合的致敏液(浸泡在一个棉花球)直接接触口腔颊部两侧黏膜处,充分湿润,一日 3 次,连续 14 天。操作过程中小心避免棉球上的抗原随吞咽动作进入食管到达胃部被消化。正常对照组小鼠采用相同剂量无菌 PBS 替代。(4)激发小鼠:第 15 天,CPE(含 CPE 10 mg/只,溶于 300μLPBS)激发小鼠通过暴露于口腔颊黏膜同时灌胃。口腔黏膜激发操作方法同上。灌胃方法:左手食指与拇指相对轻轻提拉住老鼠颈部皮肤,使其头部、颈部、躯干呈直线,另外三个小手指抓住背部皮肤将老鼠抓持在手掌内。操作者右手手持灌胃注射器,从一侧口角插入灌胃注射器,沿上腭、咽喉壁随吞咽动作进入食管到达胃部。灌胃注射器伸到底到达胃部时轻轻回抽,若无气体抽出,且观察小鼠呼吸无异常,注入激发液,注射完毕后,轻轻将灌胃针抽回。对照组同时期同剂量 PBS 替代抗原进行。(5)样本采集:4 h 后处死小鼠,经眼球采血,无菌取脾脏,收集口腔颊黏膜及空肠组织,以进行下一步实验。所有血样室温静置 30 min,4 ℃冰箱静置过夜,次日4 ℃离心机,离心 5 min,3000 转/分。吸取上层血清,分装后保存于-80 ℃待测。
..........
结果......18
讨论......25
结论......28
参考文献........29
2、综述:............34
3、致谢......43
3 讨论
在引起过敏反应的过敏原中,花生是引起Ⅰ型速发型敏反应的重要过敏原之一,微量即可引起过敏反应[35],并且花生过敏原之间交叉过敏现象非常普遍[36-37],常用于建立过敏性疾病动物模型[38-39]。说明,本研究中首选花生作为食物抗原建立 OAS 具有一定的科学合理性。资料显示,霍乱毒素(CT)佐剂可以剌激机体以增强其免疫系统的敏感性,进行动物食物过敏模型致敏实验时辅以 CT 经口灌胃致敏动物,可以增加组织渗透性引起局部的免疫反应,使动物产生更加明显的致敏反应[40]。本实验研究采用去脂的花生粗提取物和 CT 联合应用对小鼠进行免疫,能更全面地反映花生过敏原引起的 OAS 过敏反应。花生过敏原各组分的抗原性,交叉反应性,致敏途径、抗原量的变化和曝露频率等因素对于准确模拟人体 OAS 这一过程很重要,是成功建立模型的关键。处于致敏状态的动物,当一定剂量抗原再次刺激的短时间内(一般 30 min 左右),可诱导发生速发型过敏反应[41]。在我们的研究中,应用 CPE 抗原致敏口腔颊黏膜和CPE 抗原的再次激发构建 OAS 小鼠模型,数据显示,CPE 模型组小鼠激发后发生即时过敏反应,而 PBS 对照组小鼠激发前后一般情况无变化(见图 3)。与 PBS 对照组相比较,CPE 模型组过敏症状评估得分高于 PBS 对照组(见表 2)。结果表明,处于致敏状态的小鼠,当再次给予 CPE 抗原暴露后,能够激发模型组小鼠过敏反应,过敏症状表现多个靶器官受累,包括皮肤/口腔,鼻/眼症状,肠道和呼吸反应多个系统等,密切反映了人体 OAS 的临床特点。
...........
结论
成功构建了花生抗原诱导的 OAS 小鼠模型,该模型口腔黏膜过敏反应由 IgE 介导,同时伴有肠道黏膜过敏反应的发生。符合人体 OAS 的发病特点。我们的数据显示,与 PBS 对照组相比较,CPE 模型组脾脏 T 淋巴细胞培养上清液中 IL-4 水平明显高于 PBS 对照组,而CPE 模型组脾脏 T 淋巴细胞培养上清液中 IFN-γ 的表达水平无明显升高(见图 10)。说明,CPE 抗原诱导产生 IL-4 水平升高可能促进了抗原特异性 IgE 的分泌,即在细胞水平方面表现为 CD4+T 淋巴细胞更多的是向 Th2 细胞分化。另有数据表明,DC细胞还诱导免疫耐受,比如诱导 Treg(T regulatory cell, Treg)或者 T 细胞无能[58]。Treg 可以通过分泌 IL-10,TGF-β 等抑制性细胞因子,控制 T 细胞活化,抑制 Th2 细胞的分化、成熟,还可以通过下调肥大细胞的激活起到调节和维持免疫平衡的作用[59],而有些 T 细胞表达 Foxp3 转录因子是向 Treg 细胞分化的开始,调节 Th1 和 Th2 型细胞的水平,为建立机体免疫耐受等起到关键性作用[60]。结合现有的研究证明,推测本研究中 CPE 抗原诱导构建的 OAS 小鼠模型 Th2 细胞的免疫反应增强,可能是诱发OAS 发病的关键因素,也可能是体内 Th1 和 Treg 细胞亚群未产生足够水平的抑制性细胞因子如 IFN-γ,抑制 Th2 型免疫反应,最终导致 OAS 的发生。
..........
参考文献(略)