第一章 多叶重楼和云南重楼品质差异的研究
1.1 材料与设备
1.1.1 样品与试剂
2016 年 9 月，即多叶重楼及云南重楼的种子成熟期，分别在不同产地采集多叶重楼和云南重楼植物样品，各产地间距离>10 km。样品经大理大学李海峰教授鉴定为多叶重楼 Paris polyphylla Smith var. polyphylla 及其变种云南重楼 Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand. –Mazz，样品信息见表 1-1，样品洗净后在干燥箱内 40 ℃恒温干燥到恒重，得供试样品。
重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ标准品批号依次为：111590-200402、111591-200301、111592-200301、111593-200402，均购置于中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%。重楼皂苷Ⅲ、Ⅴ、H 标准品批号依次为：20170217、20180606、20170109，购置于上海金穗生物科技有限公司，纯度均≥98%。流动相甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇等其余试剂均为分析纯，实验用水为哇哈哈纯净水。
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1.2 方法
1.2.1 多叶重楼和云南重楼主要有效成分含量测定
1.2.1.1 色谱条件
色谱柱：Thermo C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）。进样量：10 μl。流速：1 ml·min-1。检测波长：203 nm。柱温：30 ℃。流动相：A－水，B－乙腈；梯度洗脱 0~39 min：20%~44% B；39~52 min：44%~60% B；52~60 min：60%~20% B。
1.2.1.2 对照品溶液的制备
分别精密称定重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H 对照品，以色谱纯甲醇为溶剂，，置 5 mL 容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容到刻度，配制成浓度分别为 0.660 mg·mL-1、0.650 mg·mL-1、0.736 mg·mL-1、0.240 mg·mL-1、0.248 mg·mL-1、0.236 mg·mL-1、0.238 mg·mL-1的对照品溶液，在 4 ℃冰箱保存备用。分别精密量取 1.00 ml 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H 对照品溶液，置 10 ml 容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容，即得到混合对照品溶液。
1.2.1.3 供试品溶液的制备
将“1.1.1”项下供试样粉碎过筛（100 目筛），并且混合均匀，参照文献[29]制备供试品溶液。40 ℃干燥到恒重。精密称取样品粉末 0.5000 g，置于 10 ml 容量瓶内，加入4 ml 75% 乙醇溶液，60 ℃ 53 kHz 超声处理 1 h 后过滤，滤液转移至另一 10 ml 容量瓶中；向滤渣中加入 75% 乙醇 4 ml，放置 8 h 后再次 60 ℃ 53 kHz 超声处理 1 h，冷却到室温后过滤，合并两次滤液，并用 75% 乙醇溶液定容，混匀，即得供试品溶液。
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第二章 多叶重楼和云南重楼主要有效成分差异的研究
2.1 材料与设备
2.1.1 原料与试剂
原料为第一章多叶重楼根茎供试样品 S1-S10，参考课题组前期实验[39]，云南重楼P1~P10 作为对照，试剂同第一章 1.1.1 项下所采用的试剂。
因不同产地多叶重楼和云南重楼根茎 HPLC 指纹图谱的相似度极低，最高仅为0.225，说明多叶重楼和云南重楼之间所含化学成分种类存在较大差异。因此，本研究拟进一步采用超高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆飞行时间质谱（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）技术对多叶重楼根茎中甾体皂苷主要有效成分进行快速有效分离，收集正离子和负离子模式下的数据信息，根据得到的[M+Na]+、[M+H]+、[M-H]－、[M+HCOO]－等准分子离子峰信息，以标准品为对照，并参考课题组建立的云南重楼质谱数据库及文献数据[31, 33-38]，对甾体皂苷主要有效成分进行定性分析。
根据不同产地多叶重楼和云南重楼根茎质谱数据分组建模，对质荷比范围 m/z 50~1500 的化学成分进行主成分分析（PCA）及主要差异峰分析，比较不同产地多叶重楼和云南重楼根茎中主要有效成分差异。
2.1.2 仪器与设备
Compact 型质谱系统（德国 Bruker Daltonics 公司），UltiMate 3000 型超高效液相色谱仪（美国戴安公司，包括：WPS-3000SL 型自动进样器，DGP-3600A 型双三元梯度泵，PDA-3000 型二极管阵列紫外检测器，Chromeleon 色谱工作站，TCC-3000 型柱温箱），其他仪器设备与第一章相同。
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2.2 方法
2.2.1 色谱和质谱条件
2.2 方法 2.2.1 色谱和质谱条件
2.2.1.1 色谱条件
Dionex Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，色谱柱：Thermo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。检测波长：203 nm。流速：0.3 mL/min。进样量：5 μL。柱温：30 ℃。流动相为水（A）－乙腈（B）（梯度洗脱 0~20 min：35%~50%B；20~40 min：50%~70%B；40~50 min：70%~100%B；50~60 min：100%~35%B）。
2.2.1.2 质谱条件
Bruker Q-TOF 质谱系统，采用电喷雾离子源（ESI），离子化模式为正离子和负离子模式扫描。气体流速：8 L·min-1，干燥气体：He，毛细管电压：4 kV，雾化器压力：253.8 kPa，离子源温度：220 ℃，扫描范围：50～1500 m/z，干燥温度：350 ℃，碰撞气体：Ar，扫描时碰撞能力：8 eV，四级杆离子能量：8 eV，六级杆射频：70 Vpp，校正液：甲酸钠溶液（Na[NaCOOH]）。 2.2.2 溶液的配制 供试品和对照品均采用第一章提取的样品溶液，液质联用进样前稀释至合适的浓度。
2.2.2 溶液的配制
供试品和对照品均采用第一章提取的样品溶液，液质联用进样前稀释至合适的浓度。
2.2.3 液质联用分析方法
按“2.2.1.1”、“ 2.2.1.2 ”项下 色谱及 质谱 条件对供 试品和 对 照品溶液 进行UPLC-ESI-Q-TOF-MS 测定，分别采用正离子和负离子喷雾电离模式进行质谱检测，得到加合分子离子峰信息（如[M+Na]+、[M+H]+、[M+HCOO]-、[M-H]-等），并收集实验数据进行分析，采用 Data Analysis 4.3（Bruker Daltonics 公司）数据处理软件分析数据，计算得到质谱图中所出峰组分可能的分子式。
用甲酸钠峰（Na[NaCOOH]，正离子模式 m/z 为 90.9766、负离子模式 m/z 为 112.9856）对 ESI 源内部进行校正，HPC 模式，搜索范围为 0.05，强度为 1000，Q-TOFmicr 外标法最大误差设置为 4 mDa（m/z<400）或 5 ppm（m/z>400）。为了更好的分离鉴定供试样品中可能存在的化合物，从色谱峰精确分子质量、碎片离子、相对峰面积和保留时间等信息，结合相关文献报道进行确定。
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第三章 云南重楼植物内生菌与甾体皂苷主要有效成分的相关性............... 42
3.1 材料与设备 ............................................... 42
3.1.1 原料与试剂 ................................................... 42
3.1.2 仪器与设备 ...................................... 43
总结 ...................................... 56
第三章 云南重楼植物内生菌与甾体皂苷主要有效成分的相关性
3.1 材料与设备
3.1.1 原料与试剂
于 2019 年 9 月在云龙关坪、剑川羊岑、洱源牛街、洱源起胜和大理凤仪 5 个云南重楼产地采集植物样品，经大理大学李海峰教授鉴定为百合科（Liliaceae）重楼属（Paris）植物——云南重楼 Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mazz，选取每个产地采集的根茎节数相同（生长年限均为 7 年）的云南重楼 2~3 株作为样品，取新鲜样品用于云南重楼内生菌研究，同时将不同产地地云南重楼根茎于恒温箱中 40 ℃干燥至恒重，用于测定含量。样品信息见表 3-1。
药学论文参考
异戊醇、异丙醇、无水乙醇、氯仿、甘油为分析纯试剂；分子生物学特殊试剂：TAE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶 K、dd H2O、DL2000 DNA marker；高氏 1 号培养基（北京索莱宝，商品编号：P8450），PDA 培养基（葡萄糖 20 g·L-1、琼脂粉 15 g·L-1、新鲜马铃薯 200 g·L-1），R2A 培养基（广东环凯，商品编号：022029），LB 液体培养基（胰蛋白胨 10 g·L-1、酵母提取物 5 g·L-1、氯化钠 10 g·L-1）。
扩增引物的通用引物购自生工生物工程公司，其中真菌通用引物为 IST1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，细菌和放线菌通用引物为 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。
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总结
（1）不同产地多叶重楼和云南重楼根茎中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H含量及重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ总含量差异较大，云南重楼根茎中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ含量及总含量高于多叶重楼；多叶重楼和云南重楼根茎的 HPLC 指纹图谱相似度较低，化学成分差异较大。
（2）从不同产地多叶重根茎中鉴定 Parisyunnanoside A、Dichotomin、Parisaponin Ⅰ、Polyphyllin G、Pseudoproto-pb、Parisyunnanoside B、Parisyunnanoside C、Parisyunnanoside D、 Parisyunnanoside E 、 Polyphyllin Ⅶ 、 Pennogenin-tetraglycoside 、 Polyphyllin H 、Polyphyllin Ⅵ、Polyphyllin B、Polyphyllin Ⅱ、Reclinatoside、Gracillin、Polyphyllin Ⅰ、Polyphyllin Ⅴ、Prosapogenin A of Dioscin、Unknown（C44H72O16）等 21 种甾体皂苷主要有效成分，分别属于原偏诺皂苷类、原薯蓣皂苷类、伪原薯
蓣皂苷类、偏诺皂苷类、薯蓣皂苷类五种骨架类型，不同产地云南重楼根茎主成分差异较大，不同产地多叶重楼根茎主成分差异较小。（3）从五个不同产地云南重楼中分离鉴定植物内生菌 347 株，共细菌 268 株（41个属 93 个种）、放线菌 20 株（4 个属 11 个种），真菌 59 株（16 个属 30 个种），植物内生菌多样性可能在不同产地云南重楼品质差异形成中发挥着重要作用。
参考文献（略）