第一节 新型冠状病毒肺炎的研究进展
1 新型冠状病毒肺炎的概述
新型冠状病毒肺炎是近年来人类遭遇的影响范围最广的全球性大流行病，对全世界而言都是一次严峻的考验[4]。2020 年 2 月 11 日，世界卫生组织(World HealthOrganization 简称 WHO)公布其正式名称：2019 冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease2019)，英文缩写为 COVID-19[5]。COVID-19 是目前全球规模最大、致死率最高的新型呼吸系统疾病，该疾病已成为全球急需攻克的难题之一。COVID-19 的病因是以湿为基本属性的疫疠之气。重型 COVID-19 的中医病机复杂，涉及毒、湿、寒、热、燥、瘀、虚多个因素[2]。COVID-19 作为一种新出现的传染性疾病，临床上一般分为轻型、普通型、重型以及危重型，不同阶段患者临床表现也有很大不同。其中重型患者临床主要表现为发热、疲劳、干咳、呼吸急促等[6]症状，重型 COVID-19 的救治十分关键，如不能及时控制则患者会转变为危重型，出现器官衰竭、休克甚至死亡等情况。部分患者在感染病毒后会产生由于机体免疫细胞、细胞因子以及趋化因子等急剧升高而引起的炎症风暴[7]，患者体内白介素等炎症因子明显上升[8]。中药则能够明显改善患者上述症状。
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2 新型冠状病毒的结构
众所周知，疫病贯穿人类历史，目前为止冠状病毒已经袭击人类 3 次，从 2003 年的 SARS、2012 年的 MERS 到 2020 年的 COVID-19，这三种病毒在基因序列上有高度的相似性，国际病毒分类委员会冠状病毒科研究组，将此次的新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2[9]。冠状病毒是一类 RNA 病毒[10]，其具有囊膜、基因组为单股正链的特点。该病毒由蛋白质和核酸组成，该病毒主要包括结构蛋白、非结构蛋白以及一些辅助蛋白。其中结构蛋白主要包括刺突蛋白（Splike, S）、包膜蛋白（Envelope membraneprotein, E）和膜蛋白（Membrane protein, M）。三者是支撑病毒颗粒形状的重要蛋白。除此之外结构蛋白中的核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein, N）包裹并保护着该病毒最重要的遗传物质 RNA。该病毒结构的三分之二为主要负责编码与病毒复制、转录相关的酶的非结构蛋白，主要包括主蛋白酶（main protease, Mpro）和木瓜样蛋白酶（Papain-likeprotease, PLpro）以及 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）等。这些蛋白不但可以合成病毒复制所需要的遗传信息，而且可转录出子代病毒所需要的结构蛋白 mRNA。辅助蛋白是多种小蛋白的总称，其主要起到协助病毒完成各个生理过程的作用。
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第二节 化湿败毒方的研究进展
1 化湿败毒方方解及疗效
化湿败毒方是一化裁方，全方由麻黄、杏仁、生石膏、甘草、藿香、厚朴、苍术、草果、法半夏、茯苓、生大黄、生黄芪、葶苈子、赤芍 14 味中药组成。麻黄宣肺、助邪外出，生石膏清泻肺胃郁热、藿香芳香化浊，三者共为君药，起到解表散寒、化湿、平喘的功效。杏仁可使肺气和顺、润肠通便，半夏化痰、厚朴行气助力、苍术燥湿健脾、草果健胃和中、茯苓安神，六药共为臣药，助君药达燥湿健脾的功效。生黄芪补脾胃之气、赤芍清热凉血散瘀、葶苈子化痰、生大黄泻下，四药相伍为佐药，起到活血化瘀、故护正气的功效。甘草镇咳、和中缓急，为方中使药，可起到调和诸药之功效。具体组方分析如图 1 所示。
该方发挥治疗作用主要从两个方面入手。其一是解毒，该部分主要由麻杏石甘汤、宣白承气汤、达原饮、藿香正气散、桃仁承气汤、葶苈大枣泻肺汤中部分药物组成，主要针对患者肺部病毒感染，起到化湿、活血、解毒、宣肺清泄等作用；其二是针对SARS-CoV-2 对患者免疫系统攻击后的损害，故黄芪赤风汤、玉屏风散为主要药物来源，主要加强机体抵抗力[11]。
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2 方剂中各单味药研究进展
2.1 麻黄的研究进展
生麻黄为麻黄科植物草麻黄、中麻黄或木贼麻黄的干燥草质茎[12]。麻黄在发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿等方面发挥着十分重要的作用。麻黄中主要含有生物碱、黄酮、木脂素、甾体、脂肪烃、挥发油类等化学成分[13]。
生物碱类为麻黄的主要成分，包括麻黄碱、伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、左旋麻黄碱、右旋伪麻黄碱、麻黄根碱 A-D 等。具有调节血压、利尿、平喘[14]、兴奋中枢神经系统等功效[15]，随着近年来对麻黄中生物碱类成分毒副作用研究的深入，麻黄在临床上的利用受到诸多限制；黄酮类及多糖类的主要成分为芹菜素、柚皮素、牡荆素、木犀草素、橙皮苷、儿茶素、山柰酚、芹菜素-7-葡萄糖苷等，药理作用主要表现为降血糖[16]、抗凝血[17]、降压[18]、抗氧化[19]等；挥发油类成分主要有二甲苯、苯乙烯、α-蒎烯、6-甲基-2-庚酮、苯甲醛等，发汗作用为其主要药理作用[20]。
2.2 藿香的研究进展
藿香为唇形科植物广藿香的地上部分。藿香有芳香化浊、和中止呕、发表解暑之功效。藿香多含黄酮，苯丙素，木脂素，三萜等类化学成分[21]。
萜类化学成分主要有广藿香醇、α-愈创木烯、百秋李醇等，具有抗锥虫等[22]作用；黄酮类成分主要有芹菜素、芹菜素-7-葡萄糖苷、香清兰苷、香草酸等，主要发挥抗病毒[23]作用；苯丙素类主要化学成分有黄药苷、异黄药苷、毛蕊花糖苷、紫葳新苷 I 等，具有抗肿瘤等药理作用[24]；挥发油类成分主要有β-石竹烯、α-蒎烯、β-蒎烯等，具有免疫调节、抗氧化、清除自由基等作用[25]。
综上所述，藿香具有保护胃肠道、抗病原微生物、抗炎、镇痛、解热、止吐、镇咳、化痰、通便、抗氧化、抗肿瘤和调节免疫系统等方面的作用[26]。
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第三节 化湿败毒方及化学成分对 PLpro 活性的影响...........................68
1 实验材料......................................68
1.1 药材与试剂..................................68
1.2 仪器.............................68
2 实验步骤...................................68
2.1 样品编号..............................68
2.2 样品的配置...............................................68
2.3 化湿败毒方对 PLpro 活性抑制检测.....................................69
综合结论............................................73
第三节 化湿败毒方及化学成分对 PLpro 活性的影响
1 实验材料
1.1 药材与试剂
化湿败毒方及 13 个单味药冻干粉、化湿败毒方中 109 个标品（10mM）（TagerMol中国，Plate layout: M27948-M27949）、DMSO 溶液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20220529）、PLpro 蛋白酶（中国科学院微生物研究所病原室平台自制）、阳性对照药 GRL0617 (MedChemExpress 生物科技公司，美国，Cat no. HY-117043) 、荧光底物(PLpro substrate) 1.8 mg（天根生化科技（北京）有限公司，Lot:C197TFK200-1/PE1301）、DTT (NO:350A0120，MW:154.25)、BSA （天根生化科技（北京）有限公司，Cat no.T1150）、PBS 缓冲液干粉（PH=7.3±0.1）（上海吉至生化科技有限公司，Cat no.AP1010）等。
1.2 仪器
96 孔板（Greiner Bio-One GmbH，德国）、Eppendorf 移液枪（Multipette E3x）、赛多利斯 SQP 型电子天平、Sorvall Legend Micro 17 型离心机（ThermoFisher Scientific公司，美国）、MINIP-2500 型微孔板离心机（杭州米欧仪器有限公司）、卡盒式 SpectraMaxParadigm 多功能酶标仪（Molecular devices Corporation，美国）、BYQ-150Z 型全自动雪花制冰机（北京佰源泉电器有限公司）等。
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综合结论
乙亥末庚子初，一种邪恶病毒名曰“新冠”席卷全球，严重危害了人类生命安全。寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫，化湿败毒方应运而生，并于 2021 年 3 月 2 日成功上市。首先，利用 UPLC-QTOF-MS/MS 对该方的化学成分谱进行系统表征及解析；随后，采用荧光共振能量转移法对化湿败毒方、方中 13 个单味药材以及方中 109 个化学成分对新型冠状病毒的 Mpro 与 PLpro 进行体外活性筛选，为后续作用机制研究奠定基础。实验结果如下：
1. 初步鉴定了化湿败毒方中的 225 个化学成分，其中，正离子模式 135 个，负离子模式 143 个（正负离子重合 53 个）。主要有黄酮类、萜类及其苷、生物碱及含氮化合物类、酰基糖苷类、蒽醌类、糖苷类、苯乙醇苷类、苯丙素类、皂苷类等。在这 225个成分中，2 个来自半夏、8 个来自杏仁、6 个来自草果、24 个来自赤芍、4 个来自茯苓、12 个来自葶苈子、12 个来自苍术、29 个来自大黄、66 个来自甘草、14 个来自广藿香、32 个来自厚朴、11 个来自黄芪、15 个来自麻黄。其中有 10 个成分为一个或多个药材共有成分。
同时鉴定方中 13 个单味药正、负离子条件下的化学成分。其中麻黄 46 个化学成分；藿香 45 个化学成分；半夏 19 个化学成分；杏仁 22 个化学成分；草果 33 个化学成分；厚朴 141 个化学成分；茯苓 51 个化学成分；苍术 52 个化学成分；生黄芪 53 个化学成分；赤芍 50 个化学成分；葶苈子 42 个化学成分；大黄 79 个化学成分；甘草 124个化学成分。
2. 化湿败毒全方在 10、5、2.5 mg·mL-1 时对 Mpro 的抑制率分别为 74.28%、44.86%、36.71%；对 PLpro 的抑制率分别为和 100.58%、84.86%、51.16%。由此可以看出全方对 Mpro 和 PLpro 均有抑制效果，且呈现出明显的浓度依赖性。对方中药材对两个蛋白活性影响检测结果显示，在 10 mg·mL-1 下广藿香、生麻黄、厚朴、甘草、葶苈子、赤芍、大黄、茯苓、草果抑制率可达到 60%以上；其中广藿香、生麻黄、厚朴、大黄、茯苓、草果抑制率可达到 80%以上。药材中 HSBDP-81、HSBDP-101 两个化学成分对Mpro 半数抑制浓度可达 16.19 µM、13.04 µM。除此之外，HSBDP-89、HSBDP-27 对Mpro 的抑制率均可达到 60%以上；HSBDP-27 对 PLpro 的抑制率也可达到 60%。
参考文献（略）