第一章 文献综述
第一节 肠道菌群及其与 2 型糖尿病的关系
肠道菌群是人体的重要组成部分，并且与其宿主一起进化。出生时获得的肠道菌群会随着宿主的发育而并行发展，并在成年后直至死亡之前一直保持其时间稳定性和多样性。基因组测序技术，生物信息学和组学的发展增加了人们对肠道菌群功能的了解。有研究表明，从婴儿到老年人，从原始部落到现代社会以及在不同的健康状况下，尽管肠道菌群是动态的，但它在人体的免疫、代谢、结构和神经系统方面仍发挥着一些基本功能，并且肠道菌群对个体的身心健康有重大影响[1]。随着对肠道菌群功能的深入了解产生了许多的新的治疗方法，例如益生元，益生菌和粪便移植等，这些方法可以有效改善人类的健康状况。T2DM 患者存在肠道菌群失调，部分降糖药物可以调节肠道菌群治疗 T2DM。
1 肠道菌群与 2 型糖尿病的关系
糖尿病是 21 世纪增长最快的健康挑战之一，患有糖尿病的成年人数量在过去 20年里增加了两倍多。2 型糖尿病是最常见的一种糖尿病。最初，高血糖水平是由于身体细 胞 无 法 对 胰 岛 素 做 出 完 全 反 应 ， 这 种 情 况 被 称 为 “ 胰 岛 素 抵 抗 ”（https://diabetesatlas.org/en/）。在社会经济、人口统计学、环境和遗传因素的复杂相互作用驱动下，糖尿病患病率持续上升。有学者提出人体肠道菌群变化是糖尿病发病的一个可能原因[2]。大规模的流行病学研究表明，与未进行结肠切除术的患者相比，全结肠切除术的患者发生 T2DM 的风险增加[3]。间接证据表明，肠道菌群以及远端肠道的激素分泌能力可能参与葡萄糖调节。肠道菌群涉及多种代谢功能，如未经消化的碳水化合物（宿主缺乏分解和利用这些碳水化合物的能量所需的酶[4]）的发酵和吸收、电解质和矿物质的吸收、肠道运动调制和部分微营养素的合成。除了代谢功能外，微生物还参与免疫系统的相互作用，提供信号以促进免疫细胞的成熟和正常功能的发展[5]，肠道菌群代谢产物也与 T2DM 的发生发展密切相关，并且肠道是第一个暴露于葡萄糖的器官，在葡萄糖代谢中起关键作用，因此，了解肠道菌群如何参与触发或维持 T2DM 及其前体状态的血糖升高具有重要意义。
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第二节 交泰丸及其治疗 2 型糖尿病的研究进展
交泰丸出自明•韩懋《韩氏医通》，是中医常用方剂，交泰丸由一寒一热的黄连、肉桂二味组成，配伍简洁。黄连属阴，苦寒入心，肉桂属阳，辛热入肾；黄连清降心火以下交肾水，肉桂温升肾水以上济心火。合调阴阳，能使心肾水火阴阳二气相交。
1 交泰丸药理作用的研究进展
交泰丸具有交通心肾、镇静催眠、抗焦虑抑郁、改善胰岛素抵抗等作用[42]。以其药简、效佳的特点广泛应用于临床。研究表明交泰丸有明显的镇静安神、抗惊厥、催眠、改善记忆减退的作用，且呈剂量依赖性[43]。
1.1 糖尿病
交泰丸方中黄连味苦性寒以清肠热，肉桂辛热温阳以除肝寒，通过现代医学肠—肝轴理论可以解释其对肠热肝寒的 T2DM 的治疗作用[44]。临床研究表明交泰丸治疗糖尿病有较好疗效，动物实验亦证实交泰丸具有降糖调脂，改善胰岛素抵抗等药理作用。交泰丸调节胰岛素分泌和抑制胰岛素抵抗的机制，可能通过促进脂联素分泌[45]和抑制tau 蛋白过度磷酸化[46]来实现。许啸虎等[47]研究证明交泰丸除降糖调脂作用外，还可以保护肾脏。
1.2 失眠
交泰丸作为经方常用于治疗心肾不交[48]。失眠是其临床适应症，交通心肾使水火既济而镇静安眠[49]。张坤瑞等[50]临床统计发现交泰丸临床治疗有效率高达 88.6%，且其突出优势为不良反应发生率较低。
黄连和肉桂配伍后治疗失眠的机制可能与其抑制血脑屏障 P-gp 功能有关，肉桂可抑制 P-gp 功能，促进黄连成分透过血脑屏障，从而抑制促觉醒神经递质 Orexin A。基于 1H-NMR 技术，采用尿液代谢组学方法从整体角度证明了交泰丸对失眠的治疗作用可能与肠道菌群代谢，神经递质的调节及机体能量代谢的干预有关[51]。
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第二章 2 型糖尿病模型大鼠的肠道菌群代谢研究
第一节 2 型糖尿病大鼠模型的复制与评价
1 实验材料
1.1 实验动物
雄性 SD 大鼠，体重 150±20g，7-8 周龄，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。
1.2 试剂与药品
链脲佐菌素（Sigma 公司，批号 NO.18888664）；柠檬酸（Sigma 公司，批号 WXBB 1835V）；柠檬酸钠（Sigma 公司，批号 WXBB4774V）；盐酸万古霉素 S17059（批号H13M11Y113102）、甲硝唑 S17079（批号 B08O10E99250）、氨苄青霉素钠 S17018（批号 Z12A11X111028）、两性霉素 B S17017（批号 A24D10L106096）、新霉素硫酸盐S17028（批号 B08O10E99250）、胆固醇（批号 No.191020）、甲基硫脲嘧啶（批号B08J11E107534）均购于上海源叶生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液干粉（北京索莱宝科技有限公司，批号 P1010）；MRS 培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号 02-293）；叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号 HB0133-1）；结晶紫中性红胆盐琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号 02-091）；沙氏琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号 02-097），戊巴比妥钠（上海北诺生物科技有限公司）；Rat FINS ELISA Kit（R&D Systems, Inc. 批号 E20201201A）；Rat HbA1c ELISA Kit（R&D Systems, Inc. 批号 E20201201A）；Rat IL-6 ELISA Kit（R&D Systems, Inc. 批号 E20201201A）；Rat IL-10 ELISA Kit（R&D Systems, Inc. 批号 E20201201A ）；甘油三酯检测试剂盒（罗氏诊断公司 Roche Diagnostics GmbH，批号 00477141）；胆固醇检测试剂盒（罗氏诊断公司 Roche Diagnostics GmbH，批号 03039773190）；低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（罗氏诊断公司 Roche Diagnostics GmbH，批号 070005717190）；高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（罗氏诊断公司 Roche Diagnostics GmbH，批号 00508610）。
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第二节 2 型糖尿病模型大鼠的肠道菌群代谢研究
本节通过代谢组学技术，探索 T2DM 模型大鼠的肠道菌群对 T2DM 宿主大鼠的生物标记物的影响。代谢组学一般使用液质联用技术对待测样品进行检测，收集得到的数据，结合模式识别技术及化学计量学处理方法对采集到的数据行分析和处理。本实验在上一节实验的基础之上，采用 UPLC-MS 手段检测大鼠的粪便；发现鉴定与 T2DM模型大鼠肠道菌群代谢相关的潜在的代谢标志物及其相关代谢通路。
1 实验材料
1.1 实验动物
第二章第一节“1.1”项下。
1.2 试剂及药品
乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 200330）；甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 190983）；甲酸（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司，批号 X075K150）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，中国）；Pierce TM LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution 批号 VC294230；PierceTM ESI Negative Ion Calibration Solution 批号 VB297632，其余试剂同上一节。
1.3 实验仪器
Thermo ScientificTM超高效液相色谱仪（Thermo Fisher 公司，美国）；Q-Exactive focus 质谱仪（Thermo Fisher 公司，美国）；单道移液器（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；超声波清洗器（上海安谱科学仪器有限公司）；冷冻高速离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电子分析天平（梅特勒托利多仪器有限公司，上海）；-80℃超低温冰箱（Thermo Fisher 公司，美国）。
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第三章 基于肠道菌群代谢标记物的交泰丸治疗 T2DM 作用研究 ................................. 53
1 实验材料 .................................. 53
2 实验方法 ............................... 53
3 实验结果 ................................................. 54
4 小结 ................................................ 59
第四章 基于肠道菌群代谢标记物的交泰丸治疗 T2DM 配伍机制研究 ............................... 61
第一节 交泰丸组成药物对 T2DM 大鼠肠道菌群代谢标记物的影响 .............................. 61
1 实验材料 ............................... 61
2 实验方法 .................................. 61
3 实验结果 ............................................. 62
第五章 综合结论 .................................... 76
第四章 基于肠道菌群代谢标记物的交泰丸治疗 T2DM 配伍机制研究
第一节 交泰丸组成药物对 T2DM 大鼠肠道菌群代谢标记物的影响
方剂是中医药临床应用的主要形式，为了提高中医药的临床疗效，必须进行方剂作用机理及配伍意义的现代实验研究。交泰丸组方精简，研究其配伍内涵对推动中医配伍理论的发展具有十分重要的意义。除此之外，交泰丸的“寒热配伍”特点，使在相同工作量的情况下，对该方进行研究可以较其他方剂获取更多的信息，达到事半功倍的效果。本实验就其对 T2DM 肠道菌群代谢标记物的影响进行交泰丸治疗 T2DM 配伍机制研究。以中医药理论为指导，本实验将给药组分为 5 组：黄连组（HL）、肉桂组（RG）、交泰丸 10:3 组、交泰丸 10:5 组、交泰丸 10:7 组，进一步研究这几种配伍情况下对 T2DM 模型大鼠的治疗作用。
分别称取黄连 550g，肉桂 550g，按照第三章制备交泰丸冻干粉的方法，制得黄连冻干粉和肉桂冻干粉。结果如下表 4-1。
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第五章 综合结论
1. 大鼠模型的评价
（1）采用高脂饮食+小剂量多次注射 STZ 法复制 T2DM 大鼠模型，模型制备成功后，大鼠血糖值稳定大于 11.1mmol/L，符合临床典型的“三多一少”的表现，相关生化指标（FINS、HbA1c、IL-6、IL-10、TC、TG、HDL、LDL、HOMA-IR）显示在模型制备成功基础上，采用代谢组学技术，从小分子物质层面显示模型制备成功。综上结果表明，采用高脂饮食+小剂量多次注射 STZ 法可以成功制备符合 2 型糖尿病特征的T2DM 模型，用于 2 型糖尿病的研究。
（2）采用连续给药混合抗生素法制备 T2DM 肠道菌群空白大鼠模型，培养基实验结果显示肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌数量极显著下降。结果表明，连续灌胃混合抗生素法可以成功制备 T2DM 肠道菌群空白大鼠模型。
2. T2DM 模型大鼠肠道菌群代谢潜在生物标记物的研究
在 T2DM 大鼠模型和 T2DM 肠道菌群空白大鼠模型建立成功的基础上，采用代谢组学技术，筛选出空白组、T2DM 模型组、T2DM 肠道菌群空白模型组的差异标记物，最终寻找并鉴定出肠道菌群代谢潜在生物标记物 21 个，代谢路径分析提示了 T2DM 模型肠道菌群代谢的 7 个关键代谢标记物为丙酮酸、富马酸、3-脲基丙酸、D-丝氨酸、D-核糖、琥珀酸半醛、龙胆酸。涉及代谢通路 15 个，分别为：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢，三羧酸循环（TCA 循环），丙酮酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，精氨酸生物合成，丁酸酯代谢，泛酸和 CoA 生物合成，磷酸戊糖途径，β-丙氨酸代谢，糖酵解/糖异生，乙醛酸和二羧酸酯代谢，半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，嘧啶代谢。肠道菌群代谢影响的代谢通路主要涉及氨基酸和糖的代谢过程，这些代谢过程与 2 型糖尿病的发生发展密切关联，证实了肠道菌群代谢与 2 型糖尿病相关。
参考文献（略）