第一章前言
补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》，主要用于治疗气虚血瘀型中风后遗症，为补气活血的代表方剂。全方组成为黄芪120g，当归尾6g，赤芍4.5g，川芎3g，红花3g，桃仁3g，地龙3g。本方重用黄芪，补益元气，意在气旺则血行，瘀去络通，为君药。当归尾活血通络而不伤血，用为臣药。赤芍、川芎、桃仁、红花协同当归尾以活血化瘀，地龙通经活络，力专善走，周行全身，以行药力，亦为佐药。在现代医学中，补阳还五汤被广泛应用于治疗缺血性脑血管病、冠心病、心肌梗塞及其它血栓栓塞性疾病。补阳还五汤沿用至今，显著的临床疗效使其备受瞩目。从复方中每单味药的角度来看，补阳还五汤的主要有效成分应该有黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、羟基红花黄色素A等。高效液相色谱法(HPLC)因其灵敏度高、分离效率好、易于操作和重复性好等特点，己成为建立中药指纹图谱及检测中药有效成分含量的重要方法之一。
本课题组前期实验对补阳还五汤含药血清通过细胞实验进行血清药理学研究[1]。但是，补阳还五汤含药血清中这种保护作用的物质基础是什么？含药血清中的哪些入血成分起作用？体内代谢对补阳还五汤化学成分有何影响？这是本课题组下一步拟解决的问题。目前尚未见到有关补阳还五汤含药血清物质基础研究报道。“血清药物化学”由日本学者田代真一提出，而“中药血清药物化学”由我国学者王喜军[2]提出，以中药口服给药后血清为样品，按传统药物化学相同的研究方法，多种现代技术综合应用，从血清中分离、鉴定移行成分，研究血清中移行成分与传统疗效的相关性，阐明体内直接作用物质代谢及体内动态的领域称之为中药血清药物化学。依据中药口服后只有移行入血的成分才可能发挥药效的思路，通过综合运用现代的提取、分析技术，对药物口服吸收后含药血清中的原型药物及其代谢产物进行分析研究，从而可直接筛选和判断出中药及复方中的有效成分并据此较快速地探明其药效物质基础[3]。
血液指纹图谱来源于将指纹图谱应用于血清药物化学研究的过程中，是指参照建立中药指纹图谱的方法，获得含有血液中全部或指定药物化学成分信息的色谱图或光谱图[4]。血液指纹图谱是以中药化学指纹图谱为基础，建立进入血液的中药化学成分的指纹图谱，其研究思路主要来源于中药指纹图谱和血清药物化学这两方面。中药血清指纹图谱是指中药经口服给药后一定时间采血，分离血清，用含药血清代替中药，经适当处理，采用现代分析手段，得到能够标志该中药药效成分特征的色谱或光谱图。即对中药、空白血清、含药血清3组指纹图谱进行比较，得到活性成分在体内的变化情况[5]。另外也有将指纹图谱技术应用于血浆中化学成分的研究，因而也产生了中药血浆指纹图谱。中药血清色谱指纹图谱和血浆色谱指纹图谱的应用可统一在血液指纹图谱之下。
本课题拟运用中药血液指纹图谱和血清药物化学研究方法，探讨补阳还五汤的药效物质基础以及移行情况，分析补阳还五汤方中起药效的主要成分。运用高效液相色谱法，测定补阳还五汤水煎液的物质基础及其含药血浆起药效作用的物质基础，分析补阳还五汤在动物体内血中有效成分的移行，为进一步阐明补阳还五汤保护缺血缺氧神经细胞的主要有效成分奠定基础。
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第二章补阳还五汤水煎液指纹图谱研究和5种主要成分的含量测定
第一节补阳还五汤水煎液指纹图谱的建立
目前，大多采用HPLC测定其极性成分[8-9]以控制其质量，本实验以补阳还五汤中有效成分芍药苷为参照物，采用梯度洗脱法建立补阳还五汤指纹图谱，为补阳还五汤的质量控制提供参考，并为进一步研究其谱效关系提供方法学依据，从而保证用药安全、有效[9]。
1.实验材料
1.1仪器
主要仪器设备名称厂家（型号）
高效液相色谱仪日本岛津公司（LC-20AT型）
紫外检测器日本岛津公司（SPD-20A型）
真空脱气机日本岛津公司（DGU-20A5型）
柱温箱日本岛津公司（CTO-10ASvp型）
自动进样器日本岛津公司（SIL-20AC）
色谱工作站日本岛津公司（LCsolution）
C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）美国菲罗门公司（PhenomenexGemini）
保护柱美国菲罗门公司（PhenomenexSecurityGuard）
电子分析天平德国赛多利斯集团（SartoriusBP211D）
中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版
1.2药物与试剂
药物/试剂名称厂家（批号）
芍药苷对照品中国食品药品检定研究院（110736-201337）
没食子酸对照品中国食品药品检定研究院（110831-201204）
阿魏酸对照品中国药品生物制品检定所（0773-9910）
羟基红花黄色素A对照品中国药品生物制品检定所（111637-200502）
毛蕊异黄酮苷对照品成都曼斯特生物科技有限公司（Must-14110905）
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第二节补阳还五汤水煎液中五种主要成分的含量测定
目前，文献报道的补阳还五汤中有效成分主要有黄芪甲苷、阿魏酸、川芎嗪、羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、山萘酚、黄芪皂苷、芦丁、绿原酸、紫檀烷苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷、芍药苷、丹皮酚、槲皮素等[16-17]。本课题前一节对补阳还五汤体外指纹图谱进行了系统研究，从中鉴定出6个成分，分别为没食子酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷以及芒柄花黄素[18]。本文拟采用高效液相色谱法对补阳还五汤水煎液中主要5种成分（羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷和芒柄花黄素）进行含量测定，旨在为补阳还五汤的质量评价提供科学依据。
1.实验材料
1.1仪器
同第二章第一节1.1项下。
1.2药物与试剂
同第二章第一节1.2项下。
2.实验方法
2.1色谱条件
同第二章第一节2.1.3项下。
本文在前期建立的补阳还五汤水煎液指纹图谱的基础上，对其中主要的5种成分进行含量测定，方法学考察结果表明，本文所建立的含量测定方法操作简单，线性范围良好，重复性和回收率高，是一种测定补阳还五汤水煎液中5种有效成分简便而有效的方法，并为补阳还五汤的质量控制研究提供了实验依据。大量文献[19-24]发现对补阳还五汤中有效成分的含量测定大多都是采用不同流动相等度洗脱，并且仅仅只是对方中的1种有效成分进行含量测定，而本文采取乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱，同时测定补阳还五汤中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮苷和芒柄花黄素的含量，结果表明在此梯度洗脱条件下，各特征峰的保留时间适中，分离度良好，基线较平稳，有利于谱图分析[25]。
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第三章补阳还五汤动态血清药物化学初步研究及血浆指纹图谱的建立........32
第一节补阳还五汤动态血清药物化学的初步研究..........................32
1.实验材料..........................................................32
1.1 仪器............................................................32
1.2 药品与试剂......................................................33
1.3 实验动物........................................................34
2.实验方法............................................................34
全文总结.................................................................54
第三章补阳还五汤动态血清药物化学初步研究及血浆指纹图谱的建立
第一节补阳还五汤动态血清药物化学的初步研究
本实验基于前期研究，对大鼠口服补阳还五汤水煎液后，在不同时间内采集血样，运用HPLC法并进行动态跟踪分析，获得其含药血浆动态图谱。
1.实验材料
1.1仪器
主要仪器名称厂家（型号）
高效液相色谱仪日本岛津公司（LC-20AT型）
紫外检测器日本岛津公司（SPD-20A型）
真空脱气机日本岛津公司（DGU-20A5型）
柱温箱日本岛津公司（CTO-10ASvp型）
自动进样器日本岛津公司（SIL-20AC）
色谱工作站日本岛津公司（LCsolution）
C18色谱柱（4.6mm×250mm,5μm）美国菲罗门公司（PhenomenexGemini）
保护柱美国菲罗门公司（PhenomenexSecurityGuard）
超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司（KQ-300E型）
HH数显恒温水浴锅江苏金坛市金城国胜实验仪器厂
冷冻干燥机美国SIM公司（Gold-SIMFD5-3）
涡旋器海门市其林贝尔仪器制造有限公司（VORTEX-6）
电子分析天平德国赛多利斯集团（SartoriusBP211D）
1.2药品与试剂
药物/试剂名称厂家（批号）
黄芪中药饮片浙江省磐安县外贸药业有限公司（140211）
当归尾中药饮片广东天泰药业有限公司（131103）
赤芍中药饮片广东天泰药业有限公司（140201）
川芎中药饮片佛山冯了性药材饮片有效公司（20131101）
红花中药饮片广东天泰药业有限公司（140301）
地龙中药饮片广东天泰药业有限公司（131003）
桃仁中药饮片陇西聚善堂中药材实业有限公司（20140428）
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全文总结
1.本研究建立了补阳还五汤体外指纹图谱，通过检测波长考察、流动相考察以及梯度考察，选出最优色谱条件，各组分色谱峰峰形良好，保留时间适中，分离度良好，基线较平稳，通过方法学考察，仪器精密度良好，样品溶液稳定性和重复性高，进一步说明本研究建立的色谱条件具有可行性。并利用《中药色谱指纹图谱相似度系统 2004A 版》软件对十批补阳还五汤水煎液进行相似度评价，结果显示 10 批样品相似度良好。对其进行色谱峰匹配，确定共有峰为 27 个，并进行色谱峰指认，对 27 个共有峰作了相应药材的来源归属。
2.在补阳还五汤水煎液的指纹图谱中，通过对照品对比，确定其中 6 种有效成分结构，并对其中的 5 种有效成分进行含量测定，方法学考察结果表明，本研究建立的含量测定方法操作简单，线性范围良好，重复性和回收率高，为补阳还五汤的质量控制提供可靠的科学依据。
3.通过灌胃 SD 大鼠，在给药后 0、15、30、45、60、90、120、150、180、240min 后进行腹主动脉取血，建立补阳还五汤血浆动态图谱，通过不同时间点色谱图的对比，发现大鼠口服补阳还五汤水煎液的 4h 内，其血中移行成分并不是一成不变，而是发生了量和质的变化，共有 30 个入血成分，其中 19 个为药源性成分，初步推测补阳还五汤的药效物质基础为这 19 个药源性成分。
4.通过分析补阳还五汤血浆动态图谱，发现在给药后 150min 的色谱图中入血成分最多，含量较高，故以 150min 为最佳采血点，建立补阳还五汤血浆指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度系统 2004A 版》软件对 5 批补阳还五汤含药血浆图谱进行评价，相似度良好。
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参考文献（略）