引 言
复方葛根片收录于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》2002 版，临床上用于治疗冠心病，心绞痛等疾病，历史悠久，取得了很好效果。随着药剂学等学科的发展，为我们更好的利用此方的价值提供了有利条件。方中葛根素具有抗心律失常，抗大脑缺血再灌注损伤，扩张动脉血管，抗心肌缺血再灌注损伤，扩张动脉血管，改善微循环的作用[1]；大豆苷具有抗脑细胞凋亡的作用[2]，与葛根素的药理作用相似。但方中丹参含有的丹参酮ⅡA 具有热不稳定性的特点，并且不同于葛根素，大豆苷水溶性的性质，提取中为了最大限度的提取出有效物质成分，选择分别提取的方法。但有些研究发现单独提取会改变部分有效物质的提取率，张爱华等[3]研究发现甘草与附子的共煎液中的黄酮含量高于单独提取后混合物中的含量。为验证单、混提取制备的复方葛根片中葛根素、大豆苷的含量是否一致，为更好的控制复方葛根片的质量标准，并进一步阐明复方葛根片中葛根这一味君药经过配伍后发挥作用的主要物质基础。血管的结构和功能随着年龄的增长而发生改变。人体中血管结构的衰老主要包括以下几个方面：①动脉血管的弹性管壁增厚，管腔扩大；②大动脉和中等大小动脉的内膜及中层钙化；③小动脉粥样硬化的发生；④毛细血管数目下降。细胞水平可见内皮细胞，平滑肌细胞形态学异常，如内皮细胞扁平，平滑肌细胞肥大等。此外可见胶原增加，弹力纤维减少、断裂，基质黏多糖沉积增加等[4]。伴随着年龄的增长，血管管腔的扩张和管壁的增厚是弹性血管在结构上发生的最明显特点。有研究显示，主动脉的直径在 65 岁以上老年人中的宽度比年轻人增加 15%-20%[5]。Lakatta 等研究发现[6]动脉内膜增厚是导致动脉管壁增厚的主要原因，中膜厚度的增加对动脉管壁的增厚影响不大。Wang 等[7]研究发现，与年轻人相比，老年人胸主动脉壁内膜增厚的程度比正常年轻人的增加了 8 倍多，然而中膜的厚度是年轻人的 1.3 倍。增龄所伴随的动脉壁厚度增加并不依赖于血压的升高。老年人动脉壁的增厚不是由血压升高而定的。平滑肌细胞由中层迁移进入内膜后大量增殖而肥大，合成释放间质，从而使内膜增厚。增厚内膜的主要成分包括胶原、纤维蛋白多糖、平滑肌细胞。
此外循环系统中的造血干细胞也是内膜下平滑肌的来源之一。间质的变化主要见于弹性纤维断裂，胶原蛋白以及糖基化终产物（AGEs）含量增加。血管衰老性重塑主要包括如下变化：管腔扩大、内膜中膜增厚、钙化增加、血管僵硬度增加及内皮功能失调、内皮更新减慢、凋亡增加、细胞活性降低、血管新生能力降低。在基因表达水平及模式变化的驱动下,在细胞因子介导下,内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及相应基质成分参与血管衰老性重塑[8]。D-半乳糖衰老动物模型目前已被众多国内外学者肯定和接受，该造模方法相比其它几种衰老模型得到的结果更加稳定，但是目前对于其致衰机理还不是特别清楚，不同文献的检测指标也各有差异。秦红兵等[9]研究发现 D-半乳糖建立衰老模型能够使小鼠的记忆功能出现下降，增加氧自由基产物的含量，降低机体的抗氧化能力以及降低小鼠的免疫功能，得出此模型可用于行为学，抗氧化，以及免疫等方面的抗衰老药效研究。但是还没有研究显示此模型对血清中 Hcy 的影响。杨惠聪等[10]研究发现 Hcy是 AS（动脉硬化）的危险因素，并且与冠状动脉粥样硬化病变程度呈正相关。王三敏[11]发现 Hcy 是颈动脉粥样硬化的独立危险因素 。张琛涛[12]研究发现冠心病血管病变支数和狭窄程度与血浆 Hcy 水平具高度相关性，病变程度越重、病变支数越多，血浆 Hcy 水平越高 。Wald[13]等研究发现血浆中的同型半光氨酸含量与心血管疾病的发生成正相关。李艾帆[14]研究发现高 Hcy 血症是河南汉族脑梗死的独立危险因素。任应鹏等[15]研究发现 Hcy 是独立于 T-cho（l总胆固醇）以外的心脑血管疾病危险因子。还有很多学者的研究结果都证实了 Hcy 是独立的心脑血管疾病风险的预测因子。所以说 Hcy 目前已被广泛证明是一种独立的心脑血管疾病风险的预测因子。随着经济社会的发展，医疗水平的提高，我国人口平均寿命不断提高，老龄化问题日趋严重，目前我国老年人口在增速和数量上均为全球第一，根据近两年的社会发展服务公告显示，法定劳动人口数量虽然高达 9.16 亿（比全球人口总数排名第三的美国全国人口还要多），但是占的比重却为 67.00%，60 岁以上人口（包含 60 岁）同样高达 2.12 亿，占的比重达到了 15.50%，65 岁人口（包含 65 岁）也已经达到了 1.38 亿（目前全球224 个国家和地区中人口超过 1 亿一共才 12 个），占总人口的比重为 10.10%。并且2.12 亿的庞大老龄人口数量也让我国成为了全球唯一一个老年人口超过 2 亿的国家。联合国的最新预测显示，在 21 世纪中期，中国 60 岁（包含 60 岁）以上老人占总人口的比重将达到 36.5%这一历史新高，届时将高于美国等绝大部分发达国家。
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实验一 HPLC 同时测定单混提取制备的复方葛根片中葛根素、大豆苷的含量
1 实验仪器和试药
1.1 主要仪器
安捷伦 1200 高效液相色谱仪，VWDG1314B 紫外检测器，超声机（AS-3120，北京华瑞博远科技发展有限公司），电子天平（BS12S,北京赛多利斯仪器系统有限公司）.
1.2 主要试药
葛根素（上海源叶生物科技有限公司，批号：YW0510YA14），大豆苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：20130728），甲醇为色谱纯，复方葛根片（济南军区总医院制剂室）.
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2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱：SHIMADZU VP-ODS 柱（250mm×4.6,5um）；流动相：甲醇（A）--0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，流速：0.9ml·min-1；进样量为 20ul。柱温 30℃，检测波长 250nm。梯度洗脱见表 1,,获得的对照品和供试品色谱图煎.
2.2 对照品溶液的制备
精密称取葛根素、大豆苷对照品 15.2mg、2.5mg，分别置于 10ml 的容量瓶中，加甲醇致刻度线溶解以备用。取 5ml 葛根素对照品溶液，5ml 大豆苷对照品溶液，溶解于 50ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成葛根素、大豆苷的混合对照品溶液。
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实验三 复方葛根片对衰老大鼠胸主动脉的保护作用.............13
1 实验材料 ....... 13
2 实验方法 ....... 13
2.1 分组及给药 ..... 13
2.2 指标的检测 ..... 14
2.3 统计学方法 ..... 14
3 实验结果 ....... 14
3.1 大鼠一般情况差异性 ............. 14
3.2 大鼠血清 hcy 的水平 ............. 15
3.3 胸主动脉血管组织病理学检测 ......... 16
实验四 复方葛根片对衰老模型大鼠血管氧化应激的保护作用.........18
1 实验材料 ....... 18
2 实验方法 ....... 18
2.1 分组及给药 ..... 18
2.2 指标的检测 ..... 19
2.3 统计学方法 ..... 19
3 实验结果 ....... 19
3.1 大鼠一般情况差异性 ............. 19
3.2 各组大鼠体重水平 ..... 20
3.3 大鼠血清中 SOD, GSH-PX, MDA 的水平 ............... 21
3.4 胸主动脉血管组织病理学检测 ......... 22
实验五 复方葛根片对衰老模型大型大鼠心脏血管线粒体膜电位及结构的影响.....24
1 实验材料 ....... 24
1.1 实验动物 ......... 24
1.2 实验试药和仪器 ......... 24
2 实验方法 ...... 24
3 结果 .......... 26
讨 论
1 HPLC 同时测定单混提取制备的复方葛根片中葛根素的含量
结果表明本实验建立的方法简便，结果可靠，重复性良好。单混提取制作的复方葛根片中葛根这一味君药的主要有效物质含量差异不显著，均符合新版《中国人民解放军医疗机构制剂规范》中的含量测定要求。中药免煎颗粒具有以市场为前提，以科研开发为基础，以生产效益为突破点，以工艺质量为保证的发展战略特点[25]。中药免煎颗粒具有吸收快，服用方便，利于管理，质量稳定可控。解决了传统中药煎服，携带，保存不便等方面的弊端[26-27]，对在工业背景下，大型机械化生产有效降低成本，减少环境污染。但免煎颗粒也有着自身的弊端，有些药物单煎和混煎的物质成分种类含量不一致，刘倩等[28]研究发现单提防风和羌活挥发油与混提挥发油成分种类发生了改变，混提后有些挥发油成分消失了，有些新产生了。孙秀梅等[29]研究发现黄连、黄柏、黄岑、栀子混合提取比单提后简单合并后的总栀子苷高 33.1%。物质成分含量不一致，效果因而受影响，林海清等[30]研究发现元胡止痛方单煎的效果好于免煎颗粒。中药在中医理论指导下，通过复方配伍可以减少某些药物的毒性。附子的毒性较大，在经典明方四逆汤中，通过与干姜与甘草的配伍可以在共煎中降低附子的毒性。复方葛根片中葛根的主要有效成分葛根素、大豆苷是水溶性的，丹参中的丹参酮类是脂溶性的，延胡索中的延胡索乙素，原阿片碱用70%的乙醇提取率最高[31].如若采取共煎的提取方法，很难用单一的溶剂高效的提取出主要有效物质，采取单独提取的方法又不确定会不会对主要有效物质含量有影响。经本实验的研究发现，单独提取不会影响复方葛根片中葛根这一味君药的主要有效物质含量的变化。提示在本方中葛根与其他几味药配伍后成分未发生显著变化，指导我们在以后的生产中可以用免煎颗粒的形式给患者服用，也可以用单提的方法提取制作片剂。
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结论
本实验探讨了复方葛根片单混煎提取法对葛根这一味君药主要有效物质葛根素，大豆苷含量变化；基于心血管疾病多发于老年人群中，复方葛根片在临床上治疗心血管疾病的良好效果，前期此方滴丸剂的抗衰老作用，D-半乳糖致衰老大鼠模型的成熟方法，探讨了 D-半乳糖与动脉硬化的关系，复方葛根片对心血管的的保护作用。对剂型的制备，临床应用和延缓衰老，预防老年多发病具有重要意义。通过建立的高效液相色谱条件和方法，准确的测定了单混煎提取葛根制成的复方葛根片中葛根素，大豆苷的含量，结果证明含量并无差异。提示单独提取的可行性，继承了免煎颗粒的优点，对促进中药现代化具有重要意义。通过同型半胱氨酸这一心脑血管疾病的风险预测因子，结合血管的组织病理图片，证明了 D-半乳糖能够引起血清同型半胱氨酸的升高，损伤血管结构，而复方葛根片能够减轻 D-半乳糖对血管的损伤，降低血清中同型半胱氨酸的水平。选取了目前对衰老较为公认的自由基学说中氧自由基上代谢途径上的关键指标，证明了复方葛根片能减轻氧自由基对血管的损伤。通过TUNEL法检测心肌细胞的凋亡，JC-1法检测心肌细胞线粒体膜电位的变化，扫描电镜观察心肌的微观结构，证明了复方葛根片能降低心肌细胞的过度凋亡，维持线粒体膜电位的稳定，减轻 D-半乳糖对心肌微观结构的损伤。未做质谱比较单混煎提取法的物质种类变化，含量测定的有效物质较少，还需进一步研究。研究 D-半乳糖致衰老模型与动脉硬化模型关系的指标太少，还需较为全面的进一步研究。衰老学说中多，自由损伤学说虽占主流，但也有自身的局限；自由基学说还包括氮自由基，对氮自由基作用还未知，复方葛根片的抗衰老作用还需扩展研究。
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参考文献（略）