引言
从天麻的主治症状来看，与缺血性脑血管病症状极其相似，有临床报道，天麻及其复方制剂治疗缺血性脑卒中能减少临床神经功能缺损评分并增加日常生活能力等级，具有良好的抗缺血性脑卒中的效果[1]；药理实验研究也证明天麻提取物对大鼠脑缺血再灌注有保护作用[2]。虽然大量的文献记载、临床报道及实验研究均提示，天麻在缺血性脑血管病的治疗中具备一定的优势，但目前国内外对天麻的研究主要局限于提取部位以及活性成分的药效学研究，仅有天麻素及其苷元[3, 4]极少部分的成分涉及了药代动力学研究，证实天麻素能透过脑屏障，并于股动脉给药后 15 分钟达到峰值，天麻苷元也能透过脑屏障。探讨药物活性成分的药物代谢动力学规律，不仅有利于揭示药物的作用机制，还是发现新药的重要途径。
我们课题组前期研究结果表明：天麻抗缺血性脑损伤的活性物质基础集中于天麻乙酸乙酯提取部位，并从乙酸乙酯部位提取分离出一组化学成分[5]，在对这些成分进行药理活性筛选的研究结果显示：4#、5#、8#和 10#成分对缺糖缺氧/复糖复氧的 PC12 细胞及缺血再灌注大鼠 MCAO 模型具有保护作用，能够舒张血管平滑肌[5]、抗血小板聚集[6]、抗氧化损伤[7-9]。一般来说药物的药理作用取决于药物是否能够到达作用部位及在作用部位的浓度，药物在血液中的浓度又常与药物作用部位的浓度密切相关[10]。本课题选取在药效学研究中筛选出来的四个活性成分作为实验用药，通过检测比较正常大鼠在给药后不同时间点血药浓度的变化，正常大鼠和 MCAO 模型大鼠在脑组织的含量变化规律。研究天麻的体内过程特点，以期发现生物活性更高、更安全的活性成分或新药的前药[11, 12]。实验所得药代动力学数据及脑脊液检测浓度数据有助于相关深入机制的研究，为实验给药剂量提供依据。
本课题是导师林青教授承担的国家自然基金项目“基于脑内分布的天麻酚性成分对缺血性脑损伤神经保护作用及机制研究”（编号：81160514）的一部分。
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1. 天麻四种成分及其代谢物的血药浓度研究
1.2 实验方法
1.2.1 HPLC 测定法的建立和确证
（1）专属性研究:
4#及其代谢物的 HPLC 检测流动相为甲醇：0.1%冰乙酸=20:80 时,柱温 30 度。4#检测波长为 287nm；4#代谢物检测波长为 255nm。287nm 含 4#和 4#代谢物血浆图见图 2，255nm 含 4#和 4#代谢物血浆图见图 4。4#和 4#代谢物的保留时间在 14.2 和 12.2 分钟左右。
5#的 HPLC 检测流动相为乙腈：水=30:70，柱温 30 度，检测波长为 230nm。230nm 5#血浆检测图见图 6。5#的保留时间在 14.0 分钟左右。
8#及其代谢物的 HPLC 检测流动相为甲醇：0.5%冰乙酸=20:80 时,柱温 30 度，8#及其代谢物检测波长为 300nm。300nm 含 8#和 8#代谢物血浆检测图见图 8。8#和 8#代谢物的保留时间在 9.2 和 7.6 分钟左右。
10#的 HPLC 检测流动相为甲醇：水=35:65 时，柱温 25 度，检测波长为 278nm。278nm 含 10#血浆检测图见图 10。10#的保留时间在 9.7 分钟左右。
（2） 标准曲线的绘制:
精密称取 3.03mg4#粉末于 50mL 容量瓶中, 乙腈定容，作为母液。制备浓度为 303.0、151.5、75.8、37.9、18.9、9.5、4.7、2.4、1.2、0.6、0.3μg/mL 的含药血。同 1.2.2 中血的前处理操作一致，制作 4#的标准曲线，y = 0.5826x - 1.9115（R2= 0.9928）
精密称取 3.03mg4#代谢物粉末于 50mL 容量瓶中,乙腈定容，作为母液。制备浓度为 303.0、151.5、75.8、37.9、18.9、9.5、4.7、2.4、1.2、0.6、0.3μg/mL的含药血。同1.2.2中血的前处理操作一致，制作4#代谢物的标准曲线，y = 0.4258x- 1.0474（R2= 0.9986）
精密称取 182.22mg5#于 250mL 容量瓶中, 乙腈定容，作为母液。制备浓度为 303.70 、151.85 、75.93 、37.96 、18.98 、9.49 、4.75 、2.37 、1.19 、0.59 、0.30 、0.15μg/mL 的含药血。同 1.2.2 中血的前处理操作一致，制作 5#的标准曲线，y = 0.8348x - 1.0198（R2= 0.9961）
精密称取 185.10mg 的 8#于 250mL 容量瓶中, 乙腈定容，作为母液。制备浓度为 77.13、38.56、19.28、9.64、4.82、2.41、1.20、0.60、0.30μg/mL 的含药血。同 1.2.2 中血的前处理操作一致，制作 8#的标准曲线，y = 0.6975x - 0.217(R2=0.9991）
精密称取 193.23mg 的 8#代谢物于 250mL 容量瓶中,乙腈定容，作为母液。制备浓度为 80.51、40.25、20.125、10.06、5.03、2.52、1.26μg/mL 的含药血。同 1.2.2 中血的前处理操作一致，制作 8#代谢物的标准曲线，y = 0.2177x - 0.4847（R2= 0.9968）
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1.3 实验结果
药物静注（口服）给药的 C-T 图，如下。药动数据经由药动软件 DAS3.0 处理，药动学参数均以非房室模型统计矩计算。
4#暴露剂量未检测到。4#的代谢物的绝对生物利用度为 26.01%。4#在血浆中的药动学研究表明，采用 DAS3.0 软件拟合后显示口服给药最合适模型为一室模型，公共权重为 3。4#成分在血液中检测到其快速转化为相应代谢物。
5#的绝对生物利用度为 12.58%。5#在血浆中的药动学研究表明，采用 DAS3.0软件拟合后显示口服给药最合适模型为一室模型，公共权重为 3。5#血液中未检测到有相应代谢物的产生。
8#的绝对生物利用度为 23.56%，8#代谢物的绝对生物利用度为 24.48%。8#在血浆中的药动学研究表明，采用 DAS3.0 软件拟合后显示口服给药最合适模型为一室模型，公共权重为 3。8#血液中检测到有相应代谢物的产生。
10#的绝对生物利用度为 44.24%。10#在血浆中的药动学研究表明，采用DAS3.0 软件拟合后显示口服给药最合适模型为一室模型，公共权重为 3。10#血液中未检测到有相应代谢物的产生。
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2. 天麻四种成分及其代谢物的脑脊液含药浓度研究......................23
2.1 实验器材、试剂和动物 ....................................... 23
2.2 实验方法 ...................................................... 23
2.2.1 HPLC 测定法的建立和确证 .................................... 23
3.2.2 给药方式及样品处理： ................................... 32
3.3 实验结果 ........................................................ 33
3. 讨论.............................................................35
4. 结论.......................................................37
3. 讨论
天麻为我国名贵中药之一，尤其以我省昭通小草坝产者最为著名。项目组前期采用药理活性跟踪分离药物有效成分的方法，对天麻抗脑缺血性损伤的作用及物质基础的研究证实天麻能有效地 MCAO 模型大鼠脑脑缺血/再灌注损伤保护作用，可明显缩小模型大鼠脑梗死体积，其活性主要位于乙酸乙酯提取部位，并从天麻乙酸乙酯提取部位分离纯化出 14 种酚性成分。
药物能够到作用部位是发挥治疗作用的前提，而血脑屏障的存在，使大多数化合物难以进入脑组织发挥作用。由于前期的研究中具有脑保护作用的天麻乙酸乙酯提取物因为脂溶性较高，推测其能够透过血脑屏障，但具体哪些成分最终能透过血脑屏障目前尚不清楚，为进一步探讨天麻抗脑缺血性损伤的作用机制，本研究在国家自然科学基金项目“基天脑内分布的天麻酚性成份对缺血性脑损伤神经保护作用及机制研究”的支持下，我们在活性筛选的基础上，以进入脑内的化学成分作为目标，通过检测在给药后不同时间点血液、脑脊液的血药浓度的变化，对这些成分在整体动物是否能够透过血脑屏障分布到脑组织中进行考察。由于药物的体内过程会受到机体病理状态的影响，在脑缺血/再灌注损伤过程中，可能会有更多的成分得以进入脑组织发挥作用，因此我们除了对正常动物进行化合物的脑内分布研究外，还采用前期研究 MCAO 的模型对化合物的脑内分布进行研究，以获得天麻脑保护的活性成分及其体内过程特点。
测正常大鼠血药浓度，获得药代动力学参数，可了解药物在大鼠体内的动态变化。实验结果表明，4#和 8#药物在大鼠体内可快速转化为相应代谢物，而 5#和 10#药物未能检测到有代谢物。
脑脊液是脑组织的组织液，有营养脑组织的作用，一般认为药物进入脑脊液后同神经细胞外液交流无阻，常用检测脑脊液中的药物浓度来反应脑内神经细胞的生存环境，各成分在脑脊液的含量可间接反映其透过血脑屏障的含量。实验结果表明：4#、4#代谢物、8#和 10#在暴露剂量下，在正常和 MCAO组脑脊液中有检测得到，5#在暴露剂量下，未在两组脑脊液中检测得到，8#代谢物未在 MCAO 组脑脊液中检测得到，提示 4#、4#代谢物、8#、8#代谢物和 10#血脑屏障通透功能较强， 5#血脑屏障通透功能较弱；且 8#代谢物在脑内的分布会受到血脑屏障功能的影响。
常规制备生物组织 HPLC 检测样品的方法有蛋白沉淀法和有机溶剂萃取法等方法。而血药浓度检测使用乙腈蛋白沉淀法。
反向 C18 柱为分析常用柱，在进行预实验时分离度良好，实验重复性高。常用反向 C18 柱的有机溶剂流动相为甲醇和乙腈。乙腈洗脱能力较甲醇强，但由于乙腈价格较贵，所以当甲醇洗脱能力足够时，甲醇为首选，故而 4#、4#代谢物、8#、8#代谢物和 10#的流动相均为甲醇，仅 5#选择洗脱能力强的乙腈。选用流动相的比例由目标成分与杂质的分离度决定，提高甲醇或乙腈有机相的比例利于目标成分的提前出峰，令检测时间缩短，节省有机相试剂，但若有机相比例过高，会造成目标成分与杂质的分离度达不到要求。经预实验选择，4#和 4#代谢物实验选用流动相甲醇：0.1%冰乙酸=20:80；5#实验选用流动相乙腈：水=30:70；8#及其代谢物实验选用流动相甲醇：0.5%冰乙酸=20:80 的流动相；10#实验选用流动相甲醇：水=35:65。4#和 4#代谢物、8#及 8#代谢物水相采用一定百分比的冰乙酸，是利用离子抑制法原理改善峰型。
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4. 结论
建立天麻四种有效成分及其代谢物的 HPLC 定量分析方法，天麻 4#和 8#药物进入大鼠体内后均有代谢物的检出。测得其绝对生物利用度在12.58%-44.24%，此外，四种有效成分在脑内的分布在正常组和 MCAO 组有所不同。4#、4#代谢物、8#、8#代谢物和 10#能透过血脑屏障，5#不能透过血脑屏障。
由于血脑屏障的存在导致血药浓度与脑组织的含药浓度有差异，脑脊液检测显现药物过血脑屏障的情况。研究分为预防性研究和治疗性研究，这在脑缺血疾病的研究中极为重要，由于脑缺血前后造成血脑屏障的损伤，影响药物的入脑率，故而将实验组分为正常组和 MCAO 组两组，分别对应预防性研究和治疗性研究。由于脑缺血疾病常伴随有血脑屏障的损伤，而血脑屏障的损伤又会影响药物在脑组织的含药浓度，故而将脑组织含药浓度实验分为正常组和 MCAO 组，分别模拟完整血脑屏障和损伤血脑屏障两种情况下脑组织的含药浓度。
4#口服给药后在脑脊液的分布情况检测中，MCAO 组 4#成分和代谢物起始吸收较低，可能是由于病理状态下药物吸收抑制造成的，2h 后药物浓度 MCAO组偏高，可能是由于病理状态下药物代谢减缓和血脑屏障破坏造成药物的蓄积有关。4#口服给药后,4#代谢物在脑脊液的分布情况不会受到血脑屏障功能的影响。
天麻 5#在暴露剂量下在脑脊液中没有检测到含量，推测 5#药物透过血脑屏障能力低。
天麻 8#成分口服给药后正常组与 MCAO 组脑脊液中基本差异无统计学意义，除了在给药后 40min 时 MCAO 组 8#代谢物浓度比正常组低差异有统计学意义，推测 8#及 8#代谢物的吸收分布与血脑屏障损伤无关，40min 时的浓度差异可能是由于病理状态下 8#转化为代谢物速度减小所致。8#代谢物口服给药脑脊液中 MCAO 组均未检测到药物，推测可能是由于病理状态下药物吸收减少所致。
天麻10#成分口服给药后脑脊液检测浓度正常组与 MCAO组差异有统计学意义，推测血脑屏障损伤造成药物透过血脑屏障增多。
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参考文献（略）