第一章 文献综述
第一节 杜仲资源基础研究概论
杜仲在很久以前就被用来泡酒泡水，被人们用来作为保健饮品服用；并且杜仲的木材也被用来做鞋、床以及家具，都具有强身健体的保健作用[3]。
入药乃杜仲的主要用途。最早关于杜仲入药的是汉医药简，并且一直到现在都被广泛应用。《本草纲目》杜仲“附方”条下，就有八种古方书，记载了十种杜仲能够治疗的疾病。杜仲的很多药用价值和用法都出自古方书中。可见杜仲入药的历史已经很久远[4]。
在李时珍的《本草纲目》中就有过记载，杜仲不仅可以作为药材有治病的作用，而且其嫩叶可以作为蔬菜用来食用[5]。
到了现在，包括我国在内的各国植物学家以及医药学家对杜仲的药理毒理和化学成分进行了系统的相关方面的研究，并且一致认为杜仲是“中国神树”，其中杜仲叶、杜仲树皮、杜仲种仁、杜仲雄花中都富含人体所需要的矿物质元素和营养成分，所以药用含量高，种类比较齐全[6]。
从杜仲中提取得到的松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸、桃叶珊瑚苷、多糖等多种活性成分均有降血脂、降压的作用，同时还能促进冠状动脉血液循环，治疗心血管疾病[7-8]。
宇航员由于在太空中失去重力的作用，会加快身体老化，钙质流失，容易得骨质疏松等一系列老化疾病，现代研究已经发现，杜仲在抗骨质疏松等老化疾病方面有着神奇的疗效，因此美国宇航局已经将杜仲作为宇航员在太空的必备食物[9]。
研究发现杜仲中含有的京尼平苷、桃叶珊瑚苷在减弱有机磷酸类农药的危害方面有着显著的作用，并且可以降低吸烟、喝酒对身体的危害。同时杜仲可以防止染色体变异，从而防止细胞癌变而引发的癌症[10]。
杜仲的抗衰老作用体现在抵抗骨质疏松。研究表明，杜仲籽总苷对大鼠的骨微结构有影响作用，大鼠每日口服杜仲籽总苷提取物 (TGEUS), 骨骼的机械变化与骨密度（BMD）增加，同时股骨的生物力学也会增加，微架构也会改进。在对大鼠的骨密度试验中发现，杜仲能够有效的增加骨密度，从而在治疗骨质疏松等衰老疾病方面有着显著疗效[12]。
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第二节 杜仲内生菌研究概论
近年来对杜仲内生菌方面有了越来越多的研究，现将研究成果列表如下：
综上所述，杜仲内生真菌的存在具有普遍性和多样性，目前从杜仲中分离到的内生菌分属10余属，且地域、采集部位的差异性带来菌株的多样性。目前研究重点集中在两个方面，一方面是和分离产绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷的菌株，这些植物中的基因是否能在内生菌中持久保留则缺乏研究。另一方面是简单研究了抗菌性、抗氧化活性。病菌对现有抗菌药品产生抗药性是农业和医学面临的一个难题，已有研究已证明杜仲内生菌具有抗菌活性，但缺乏对抗菌活性成分的分离及抑菌机制的深入研究。本研究拟从河南大学校园内的杜仲叶片和果实中分离内生真菌，以植物和人类致病菌为目标，筛选拮抗菌株，为进一步分离生物活性物质打下基础。
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第一章 文献综述..................................................1
第一节 杜仲资源基础研究概论.......................................1
1 历代杜仲的利用范围 ........................................... 1
2 现代对杜仲的利用范围............................................... 1
3 杜仲的药理活性................................................2
第二章 杜仲内生菌的分离、纯化、菌种保藏以及菌种鉴定...................7
1 试剂与仪器 ....................................................... 7
2 试验方法..................................................... 8
2.1 杜仲内生真菌的分离与纯化....................................8
2.2 拮抗菌株的筛选...................................9
第二章 杜仲内生菌的分离、拮抗菌种的筛选及分子鉴定
1 试剂与仪器
1.1 试剂与材料
试剂 琼脂粉，蔗糖，蒸馏水，无水乙醇，75%乙醇，2%次氯酸钠溶液，甲醇（色谱纯）,磷酸(色谱纯），醋酸，蒸馏水。绿原酸（中国药品生物制品检定所），桃叶珊瑚苷（中国药品生物制品检定所），黄酮类化合物（槲皮素、芦丁）（中国药品生物制品检定所），宝生物工程（大连）有限公司 DNA 提取试剂盒。
材料 河南大学植物园随机选取 5 棵健康的杜仲树，摘取新鲜树叶和果实置于无菌保鲜袋中，放于 4℃冰箱保存备用。
供试病原菌：其中植物源病菌有：禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis)，小麦根 腐 病 (Drechslera Sofokiniana) ， 小 麦 赤 霉 病 禾 谷 镰 孢 (Fusariumgraminearum)，蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)；人类致病菌有：金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)，白色念珠菌 (Monilia albican)，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)，大肠杆菌 (Escherichia col)i。
测试菌：分离纯化所得杜仲内生真菌。
1.2 仪器
光照恒温培养箱（上海一恒科技仪器有限公司），MG96+型 PCR 仪（杭州朗基科学仪器公司），JY600 双稳定时电泳仪（北京君意东方电泳设备公司），MM400 混合球碾磨仪（德国 Retsch 公司），I26型恒温摇床（英国 New Brunswick Scisntific 公司），D-37520 型离心机（德国Thermo Electron LED GMBH 公司），101-2AB 型电热鼓风干燥箱，KQ5200DA型数控超声清洗器，FA1004 型电子天平，Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司，包括 G1311C 四元梯度泵、G1329B 自动控温自动进样器、G1316A 柱温箱、G1314B 可变波长紫外检测器、ChemStation6.01 色谱工作站），移液枪，移液枪头，打孔器。
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2 试验方法
2.1 杜仲内生真菌的分离与纯化
2.1.1 PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）的制备
将马铃薯削皮切成 1cm3大小，放入烧杯，加水至 1000mL，加热沸腾并不停搅拌，将马铃薯煮烂（煮沸 20~30min，能被玻璃棒戳破即可）（即 A 液）。用8 层纱布过滤 A 液，将滤液定容至 1000mL（B 液），加入 20g 蔗糖，12g 琼脂粉，加热搅拌至完全溶解。趁热将培养基倒入锥形瓶中，封口膜和牛皮纸封口，放入灭菌锅中，121℃，灭菌 20min，留做备用[32]。
2.1.2 PD（马铃薯葡萄糖培养基）的制备
将马铃薯削皮切成 1cm3大小，放入烧杯，加水至 1000mL，加热沸腾并不停搅拌，将马铃薯煮烂（煮沸 20~30min，能被玻璃棒戳破即可）（即 A 液）。用8 层纱布过滤 A 液，将滤液定容至 1000mL（B 液），加入 20g 蔗糖，加热搅拌至完全溶解。趁热将培养基倒入锥形瓶中，封口膜和牛皮纸封口，放入灭菌锅中，121℃，灭菌 20min，留做备用[33]。
2.1.2 杜仲内生真菌的分离、纯化以及保藏
随机选取 5 棵健康的杜仲树，摘取新鲜且无损伤的树叶和果实，清洗干净，将杜仲叶子分切成长 1.5 cm 左右，宽 1 cm 左右的叶片，分为三份，分装于三个 100mLl 锥形瓶中；果实同样分装于三个 100 mL 锥形瓶，将试验用到的材料和器材放入工作台内，紫外灯照射 20~30 min，风扇开至接种完成；将紫外灯关闭，用酒精棉球擦手消毒；用 75%乙醇分别清洗之前准备的三份叶片和果实 30s；2%次氯酸钠溶液将第一份叶片和果实灭菌 2 min，第二份叶片和果实灭菌 3min，第三份叶片和果实灭菌 5min；用无菌水将每份叶片和果实清洗 5~6 遍，解剖刀、镊子、用酒精灯灭菌；将培养基瓶口靠近酒精灯外焰，用镊子把叶片和果实压紧在培养基上，用封口膜和牛皮纸封口。用最后一次清洗的无菌水做空白对照试验。将接种后的培养基放置于恒温培养室中培养。记录好真菌长出的时间，接种 4 天之后长出的内生菌用 1/4 划线法在 PDA 培养基平板上进行划线纯化，将纯化后的菌种接种两份保藏于 4℃冰箱保藏备用[34-36]。
2.1.3 形态学分类
菌种平板培养后，按照菌落形态特征和显微形态特征进行形态学分类。菌落形态特征可以从菌落颜色、菌落形状、菌落边缘等方面特征进行鉴定。显微形态特征则是挑取菌丝制成玻片在光学显微镜下进行观察，记录孢子和菌丝形态，进行形态学分类[37-38]。
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4 讨论
4.1 内生真菌分离培养时外植体的消毒是最基础也是最为重要的环节，成功获得无菌植物材料与外植体的类型、取材时间、消毒剂的种类和浓度、处理时间等因子密切相关。常用的灭菌药剂有 75%的乙醇、2-10%的次氯酸钠、0.1%的升汞、双氧水以及市售各种品牌的消毒液等，其中乙醇和升汞配合最为常用、灭菌效果最好。本实验在用 75%的乙醇和 2%的次氯酸钠溶液配合使用，获得了理想的消毒效果，其最后一次清洗水中均不存在细菌或真菌[50-52]。
4.3 最早开展药用植物内生菌的研究的是美国蒙大拿州立大学的 Strobel 团队，他们于 1993 年首次从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）的韧皮部中分离到一株产生抗癌物质紫杉醇的内生真菌安德氏紫杉霉(Taxomyces andreanal)。红豆杉及其同属药用植物生长缓慢、自然资源有限，且紫杉醇含量极低，这一发现为人类解决类似问题提供了新思路，植物内生菌的研究开始迅速发展，随后，人们掀起了对植物内生菌及其活性物质开发的热潮。内生真菌产生植物次生代谢物质的原因尚不明确，其原理可能是在长期协同进化的过程中，内生菌与宿主植物相互影响，两者常具有相同或相似的次生代谢产物合成途径。关于内生菌与植物可以产生相同或相似的生物活性物质的“协同进化” 机制，目前主要有两种解释。一种是“基因传递理论”。该理论认为宿主植物与内生菌长期共同生活，结果发生了基因的遗传交换或者基因的直接传递，使得它们具有了相同的次级代谢产物合成途径。Li 等在探讨红豆杉与特定的内生真菌都具有紫杉醇合成能力时认为，在红豆杉与内生真菌之间可能发生了水平的基因传递，使得某些真菌可以产生紫杉醇。另一种是“内共生理论”。该理论认为，次生代谢过程中生物化学途径的连续演化会导致有益物质进入到共生体中，其基本的生化过程信息有时还会传递到其它生物中去。本研究分离到了 91 个菌株，结果发现两个菌株在初代培养中可产生绿原酸，7 个菌株可产生桃叶珊瑚苷，但在随后的培养中却无法检测到这些杜仲的主要活性成分的存在，说明杜仲在与这些菌株长期共同生活过程中，发生了基因的遗传交换或者基因的直接传递，使得这些内生真菌具有了绿原酸或桃叶珊瑚苷的次级代谢产物合成途径。Chen 等从四川成都的杜仲皮中分离的 29 株内生真菌中，2 株可以产生桃叶珊瑚苷，培养 5 代仍可产生桃叶珊瑚苷，而我们的结果是第二代就无法产生杜仲次生代谢物，结果显然不一致，其原因尚需进一步研究[54]。
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5 小结
5.1 通过 1/4 划线法对河南大学药用植物园内的杜仲进行内生菌分离与纯化，将分离所得的内生菌进行了菌落形态进行初步分类，共得到 91 个菌株。
5.2 对试验分离所得的杜仲内生菌的发酵产物进行主要的有效化学成分进行检测，其中有 7 株菌能够产生桃叶珊瑚苷、2 株菌能够产生绿原酸。
5.3 对分离所得的内生菌进行了生物活性抑菌实验检测，11 个菌株对至少1 种病原菌有拮抗作用，尤其是对植物病原菌的拮抗作用更强。
5.4 分子鉴定表明，1、2、7、9、11、16、18、23、26、27、29、30、42、46 号菌株属于链格孢属 Alternaria，4 号菌株属于黑孢属 Niqrospora，31、49 号菌株属于枝孢属 Cladosporium，41 号菌株只能确定其归属为子囊菌门Ascomycota 座囊菌纲 Dothideomycetes。
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参考文献（略）