引 言
鸭病毒性肝炎目前已成为困扰养殖业的重大疾病，是一种高度致死性、传播速度快的病毒性疾病，临床上主要特征表现为肝脏出血、坏死、水肿，该病主要侵害 3 周龄以内的雏鸭，不仅对畜牧业造成严重损失，同时对喜欢吃鸭肉的消费者的健康来说无疑是一种严重的、潜在的威胁，因此近年来致力于研制出对抗此类疾病的西药或者中药制剂一直是科研工作中的热点问题。现在西药一般是合成药物，使用过程中易产生耐药性，而且随着注射次数的增加，也会导致鸭厌食、惊厥等一系列的应激反应，导致鸭死亡率的增加，从而增加了鸭养殖户的资金的投入，然而随着中药学的不断发展，天然中药材在对人类病毒性疾病的防治中起着至关重要的作用，引起了人们越来越多地关注，因此中草药在家禽病毒类疾病防御和治疗中的应用成为将来治疗家禽疾病的主要趋势。
现代药理学研究表明部分中草药中也含有抗病毒的活性成分，能够有效预防病毒的增殖和扩散，而且兼有调理气血、疏肝理脾、提高机体免疫力的功能。中药蟾酥主要药效是解毒，止痛，开窍醒神，现在药理表明其中含有中药蟾酥成分的华蟾素注射剂就具有很好的治疗雏鸭肝炎的效果，但由于注射次数频繁，引起雏鸭一系列的应激反应，因而限制了其在治疗雏鸭肝炎的临床应用，近年来，利用新型辅料制备的缓释制剂的研究报道逐渐增多，新型辅料的应用日益受到医药研发者的关注，在治疗疾病方面缓释制剂减少注射次数同时药物可缓慢地释放进入体内，而且药物血药浓度“峰谷”波动小。不仅能够避免超过治疗血药浓度范围引起的毒副作用，又能同时保持药物在有效浓度范围（治疗窗）之内，从而维持其相应的疗效。因此研制出蟾酥缓释制剂对抗此类疾病有极大市场前景。
本文以中药蟾酥为模型药物，对肌内注射用温敏型水凝胶进行了研究，并制备具有适宜相转变胶凝温度的温敏型凝胶，探讨凝胶中药物的释放规律，同时对该温敏凝胶雏鸭在体实验应用后的药效学进行研究，以期为兽药温敏型型缓释制剂的类似研究提供参考。
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第一章 文献综述
第一节 鸭肝炎的研究进展
研究表明[1]，鸭病毒性肝炎是由三种不同类型的病毒引起的，主要包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒（DHV），但除了以上三种能够引起鸭类肝脏疾病的病毒外，同时在野鸭和家鸭中发现一种嗜肝 DNA 病毒（乙型肝炎病毒）。依据 DHV-Ⅰ病毒形态和血清学特性等方面，属于小 RNA 病毒科 (Picornaviridae) ，肠 道病 毒 属(Enterovirus)。Ⅱ型鸭肝炎病毒属于星状病毒科，星状病毒属。Ⅲ型鸭肝炎病毒属于小 RNA 病毒科，但与 I 型 DHV 无关[2]。新型鸭肝炎病毒也属于小 R-NA 病毒科，与Ⅰ型鸭肝炎病毒具有相同的基因组结构。鸭乙型肝炎病毒是一种小 DNA 病毒，属于嗜肝 DNA 病毒群[3]。
Ⅰ型鸭肝炎病毒主要侵害雏鸭，在其群体中具有较快的传播速度。该病主要临床特征是死亡率高、传播迅速、潜伏期短，而且现有的研究显示该病具有很强的接触传染性。Ⅰ型鸭肝炎病毒主要经消化道和呼吸道途径在雏鸭群体中进行传播，而且被感染的鸭和康复后的鸭排出的粪便等排泄物，正常鸭接触后，也会被传染，导致其发病，从而加速了本病在鸭群中传播，以致于由于发病迅速，不能得到较好的控制，导致较高的死亡率[8]。通过调查表明，鸭病毒性肝炎的发生和流行并没有明显的季节性规律，但发病高峰期主要是在春季育雏阶段。临床统计结果显示鸭死亡率与鸭龄期有一定的关联，小于 1 周龄的雏鸭死亡率可高达 95%，而相对小于 1 周龄的雏鸭，1～3 周龄雏鸭的死亡率则为 50%或者更低。另外研究发现鸭日龄不断增大的同时易感性降低，甚至不发病或不死亡，死亡率明显较低，这可能与鸭免疫抵抗能力增加有关。
Ⅱ型鸭肝炎病毒感染途径主要有口腔、泄殖腔和皮下感染，雏鸭在感染后 1～4 d 内大部分会出现死亡[9]，且小部分有幸存活的雏鸭，在感染后也至少需要排毒 l 周，之后发现其正常生长，并没有发现存在发育迟缓的迹象。Ⅲ型鸭肝炎病毒相较于Ⅰ型鸭肝炎病毒，对雏鸭的感染并没有那么严重，其主要感染途径为皮下、肌肉和静脉注射，而且临床统计结果显示雏鸭的死亡率很少超过 30%[10]。
鸭肝炎病毒的致病机制主要是 DHV 进入机体后，3 h 内迅速分布到全身器官组织，并在组织细胞中大量增殖，造成组织细胞损伤，从临床观察结果可以看出，该病主要表现为肝脏出血性坏死性炎症，胆管增生，脾脏的坏死性脾炎，胰脏的局灶性坏死，肾小管上皮细胞的变性坏死等，同时由于病毒的大量增殖，导致机体的结构异常和代谢功能障碍，从而引起动物机体死亡。然而并不是所有感染机体会发生死亡，部分感染雏鸭耐过而存活的，在其组织如胰脏中还存在有病毒，并且向体外排毒，成为疾病传染源，从而造成新的感染群体，若不能及时控制，将会对鸭群造成更严重的后果。
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第二节 中药蟾酥概述
1 蟾酥药理作用
1.1 对心血管的作用
1.1.1 强心作用
临床上小剂量蟾酥具有增强离体蟾蜍心脏的收缩力的效果，而大剂量的使用反而出现相反的效果，研究表明其可以减慢麻醉猫、犬、兔、蛙的心跳。研究表明蟾酥中含有的蟾毒配基类和蟾蜍毒素类化合物均有强心作用，但是前者的作用更强，而且实验研究表明其正性心力作用与洋地黄相似，但是并不存在蓄积作用[21]。关于其强心机制具有不同的看法，但大部分研究学者认为蟾酥主要强心机制是蟾毒配基通过抑制心肌细胞膜上的 Na+-K+-ATP 酶，减少 Na+外流，导致心肌细胞内 Na+浓度增高，从而增加了 Na+-Ca2+之间的交换，是心肌细胞内 Ca2+浓度增加，从而导致心肌收缩力增强[22-23]。然而禹永春等[24]的研究结果另外证实，蟾酥可以通过作用于 α-受体，从而作用于钾通道使离体蟾蛛心脏收缩运动增强。
1.1.2 对心肌缺血的影响
现代药理学研究表明蟾酥升高血压的作用主要来自周围血管的收缩，部分来自心动作用，此作用可被受体阻断剂阻断。实验研究表明蟾酥中的成分如蟾毒灵、华蟾毒配基以及华蟾毒素静脉注射(0.05 mg/kg)均可引起麻醉兔的呼吸兴奋和血压上升，呼吸兴奋是中枢性的，其中升高血压作用最强的是蟾毒灵[28]。
1.2 抗肿瘤作用
1.2.1 肝癌
丁诗语等[29]通过研究不同浓度蟾酥注射液对人肝癌细胞 BEL-7402 作用，结果通过流式细胞仪检测可见各组细胞 G1，S 期下降，G2/M 期升高，产生凋亡峰，表明蟾酥注射液可以诱导人肝癌细胞 BEL-7404 凋亡。黄应申等[9]探讨了脂蟾毒配基（RG）诱导人肝癌 Bel-7402 细胞凋亡的作用机制，结果表明，RG 可能是通过线粒体通路诱导人肝癌细胞 Bel-7402 细胞凋亡。陈小义等[30]研究表明 BL 对 SMMC7721 细胞具有显著的细胞毒作用，大部分细胞死亡以凋亡为主。韩欣汝等[31]研究了蟾酥中脂蟾毒配基、华蟾酥毒基和蟾毒灵三种成分单体对 BEL-7402 人肝癌细胞的抑制作用，研究结果表明蟾酥其中的三种成分单体对 BEL-7402 人肝癌细胞增殖的抑制作用强弱顺为蟾毒灵华＞蟾酥毒基＞脂蟾毒配基。
温敏型聚合物泊洛沙姆是由聚氧乙烯(polyethylene oxide，PEO)和聚氧丙烯(polypropylene oxide，PPO)组成的 ABA 型嵌段共聚物。而其中研究较为深入的而且最常用到的一种聚合物是 P407 是最常用到的。P407 特性有毒性低、生物相容性好、特殊的反向热胶凝的性质。但研究表明 P407 的浓度越高，伴随着胶凝温度的降低，凝胶黏度则同时增大，这无疑会给注射造成困难，对注射部位也会产生的剌激性也会相应的增加。另外研究发现加入一定比例的泊洛沙姆 188，使其混合均匀，可以起到提高其胶凝温度的作用。陈燕军等[8]采用 16%的泊洛沙姆 407 和 6%泊洛沙姆 188 为主要基质，以中药肿节风提取物为模型药物制备了注射用温敏原位凝胶，对其胶凝温度进行测定以及体外释药模型进行拟合。结果显示该制剂的胶凝温度为 33 ℃，体外释放行为符合 Higuchi 方程[56]。
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第三章 蟾酥温敏凝胶注射液的质量标准及稳定性研究 ..................35
1 仪器与试药 ................................................ 35
1.1 仪器设备 .................................................. 35
1.2 药品与试剂 ................................................ 35
2 供试样品的制备 .............................................. 35
第四章 蟾酥温敏型注射液的雏鸭在体实验初步研究...................48
1 动物与药品 ..................................................48
2 方法与结果 ...................................................48
2.1 雏鸭 AVIZ111 毒株接种 ......................................48
2.2 分组 .........................................................48
结 语............................................................52
第四章蟾酥温敏型注射液的雏鸭在体实验初步研究
鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种高度致死性传染病，而前期采用蟾酥注射液进行药效学实验具有一定的疗效，但是有由于注射次数较多，引起雏鸭的厌食、精神不振等一系列的应激反应，从而导致较低的治疗效果，而近几年报道的采用新型温敏型辅料制备的缓释制剂能够可克服这一缺陷，因此本课题采用温敏型辅料制备了蟾酥温敏型注射液，以期达到更好地疗效。本部分实验通过蟾酥温敏型注射液与蟾酥注射液以及西药金刚烷胺粉剂对照，对蟾酥温敏型注射液的雏鸭在体实验药效学进行初步研究。
1 动物与药品
1 日龄无母源抗体的雏鸭 150 只；西药金刚烷胺粉剂（江苏倍康药业提供，规格 0.2 mg/ml）；蟾酥注射液（购自安徽凤阳科苑药业有限公司，规格 2ml/支）；蟾酥温敏型注射液（自制）；鸭肝炎 AVIZ111 毒株（由中国兽医药品监察所提供）。
2 方法与结果
2.1 雏鸭 AVIZ111 毒株接种
将 1 日龄无母源抗体的雏鸭 150 只，饲养至第七日龄，将其中 120 雏鸭按0.2ml/只 1:100 病毒液(生理盐水稀释)[73]注射，剩余 30 只注射相同剂量的生理盐水。
2.2 分组
取 7d 感染后的 120 只雏鸭，随机分成 4 组，每组 30 只。第 1 组注射蟾酥注射液 0.25 ml/只，连用 7 d；第 2 组西药金刚烷胺粉剂每次 1 mL/只，每日 2 次，连用 7d；第 3 组蟾酥温敏型注射液注射一次 0.25 ml/只(只注射 1 d)；第 4 组感染对照组和第 5 组空白对照组不用任何药物治疗。
2.3 观察记录
观察各组绍鸭的临床症状，并比较其严重程度，记录死亡数、存活数，观察至 12 d 后结束。
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结 语
本课题主要研究用于治疗雏鸭肝炎的中药缓释制剂，对其制备工艺、质量标准进行了研究。在制备工艺研究中，采用多指标成分筛选确定制备工艺路线，并对确定的工艺进行了参数细化，该制剂的工艺基本稳定，先进可行，适于生产。在质量标准研究中，采用高效液相色谱法对华蟾素毒基及脂蟾酥配基进行了含量测定，建立了科学、合理、可控的质控体系。
本课题致力于注射剂的新剂型研究，通过对模型药物蟾酥提取工艺以及新型温敏型辅料具体参数的优化，制成适宜治疗雏鸭肝炎的缓释制剂，既保持了制剂较好的疗效，又减小了注射次数，降低由于多次注射引起的雏鸭的应激反应。本制剂的研究，不仅对雏鸭肝炎有非常重要的现实意义，而且对推动兽药新剂型发展具有重要意义。
本课题尚存在不足之处，对本制剂在体药效学只是进行了初步研究，并没有深入，而且前期做过本制剂的小鼠在体药动学研究，但结果虽然显示有缓释效果，但数据并没有较好的检测效果，考虑是检测器无法较好的检测出，因此本制剂的药效学和在体药动学需要进一步考察研究，同时为了使本制剂达到完善、全面的控制，在后期将会对制剂治疗雏鸭肝炎作用机制进行深入研究。
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参考文献（略）