引 言
现代对中药及复方的研究方法主要有中药化学研究和中药药理学研究两个方向。中药化学的研究主要沿着两条思路进行，一是从中药的传统功效出发，利用单一中药或对中药复方拆方提取有效成分，发现先导化合物，再进行结构修饰或简化，如我国自行开发的青蒿素等；二是在中医药理论指导下，对方剂的君、臣、佐、使，以及整体观念、协同配合的药物组合理论等的物质基础进行研究。然而，每个药材含有多种化学成分，因此对中药及复方的物质基础研究难度非常大。如何判断药物的有效物质基础？如何判断多种中药含同一种化学成分时该成分与全方的药效关系？单体化合物体外有效体内效果不佳等各种问题交织在一起，使研究困难重重。中药药理学研究经过数十年的努力正在逐步走向成熟，研究的层次包括动物整体水平、器官水平、细胞水平和分子水平等；研究的材料包括粗提取物、有效部位、有效单体化合物以及含药血清、药物原形及其代谢产物等；研究的手段主要采用各种现代药理学研究方法，多年的实践也创造出了一些中医药研究独特的方法，如证的动物模型、血清药理学等，同时吸收了其他学科的先进思维和手段，如计算机、数学、物理学、化学、分子生物学、统计学等，这些不同学科交叉的结果为中药药理学的研究拓宽了思路。随着研究的不断深入，人们发现中药药理学研究亦存在着众多的缺陷和不足，甚至阻碍中医药现代研究的深入。
中医药是以“整体观”、“辨证论治”、“个体诊治”为精髓的系统的理论体系, 中药及其复方具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，如何利用现代科学技术手段对中医药进行“整体理性”的研究，阐明中药复方的作用成分、作用机理、中药药性理论等丰富内涵，是中药现代化研究的热点和难点。
本课题在传统方药理论的指导下，引入系统药理学方法，预测四君子汤的活性成分和作用靶点，并通过动物实验，选择四君子汤的主治证模型为工具，观测四君子汤的药理作用及对预测靶点基因表达的影响。因自清代《本经逢原》之后，大多以党参代替人参使用, 现代临床中，人参也多以党参代替，因此本课题在对四君子汤的研究中选用党参。
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第一部分 文献研究
1. 四君子汤研究概况
1.1 四君子汤历史溯源
1.1.1 四君子汤命名缘由
四君子汤乃补气健脾之基本方剂，首载于《太平惠民和剂局方》，后世诸多补气或健脾方剂如参苓白术散、异功散、六君子汤、香砂六君子汤、归芎六君子汤、七味白术散等均由四君子汤衍化而来。此类衍化方在组成上由四君子汤加减而成，功效主治也各有侧重，但临证总以脾胃虚弱为辨证要点，以补气健脾为立方大法。如《太平惠民和剂局方》中的八解散，由四君子汤加半夏、厚朴、陈皮、藿香组成。用治“劳伤过度，饮食无味，四肢疼倦”等。该书卷三中的参苓白术散，是在四君子汤基础上加山药、莲子、扁豆、砂仁、薏苡仁、桔梗等品组成，主治变为脾虚夹湿证，临证以气短乏力、肠鸣泄泻、舌淡苔腻、脉虚缓为辨证要点，为祛湿止泻、培土生金的代表方剂。《小儿药证直诀》之异功散，由四君子汤加陈皮而成。功可益气健脾，行气化滞，主治脾胃气虚兼气滞证，临证以胃脘闷滞、不思饮食、大便溏薄或呕吐、泄泻为主。同书之七味白术散，原名白术散，由人参、白茯苓、炒白术、藿香叶、木香、甘草、葛根组成，全方融补、运、升、降为一体，功效健脾生津，行气消胀，用于治疗脾胃久虚，津液内耗，呕吐泄泻频作，烦渴多饮。《阎氏小儿方论》中的和中散，由四君子汤加黄芪、炒扁豆、干葛、藿香叶组成，功可止吐泻，定烦渴，主治小儿腹痛吐泻，烦渴厌食。《鸡峰普济方》之六神散，由四君子汤加百合、黄芪组成，功可调适阴阳，和养荣卫，主治脾胃虚弱，肌体瘦瘠，不思饮食，咽干口燥。《脾胃论》之补中益气汤，为李东垣治气虚发热而设，由四君子汤去茯苓，加黄芪、柴胡、升麻、橘皮、当归身组成，全方补气与升提并用，使气虚者补之，气陷者升之，气虚发热者甘温益气而除之，使元气内充，清阳得升。《正体类要》之八珍汤，由四君子汤加四物汤（当归、白芍、熟地、川芎）而成，功用益气补血，主治气血两虚证，为治疗气血两虚之基础方。《医学正传》之六君子汤，由四君子汤加半夏、陈皮组成，功可益气健脾，燥湿化痰，主治脾胃气虚兼痰湿证。《赤水玄珠》中的参术汤，由四君子汤加陈皮、黄芪而成。用治“气虚颤掉，泄泻、呕吐”。《景岳全书》之五君子煎，由四君子汤加干姜组成，实为该方与理中丸之合方，主治脾胃虚寒，呕吐泄泻而兼湿者。《古今名医方论》中的香砂六君子汤，由四君子汤加陈皮、半夏、木香、砂仁而成，功效益气健脾，行气化痰，主治脾胃气虚，痰阻气滞证。《博爱心鉴》之保元汤，由四君子汤去白术、茯苓，加黄芪、肉桂而成，功效益气温阳，主治虚损劳怯，元气不足证。
研究发现[24-25]，用利血平制作脾虚大鼠模型，四君子汤能显著提高大鼠血浆胃动素和胃泌素的含量，降低大肠中增高的前列腺素 E2 水平和血浆胰高血糖素含量，较好的改善脾虚证的胃肠功能。魏彦明研究发现，四君子汤能使脾虚大鼠的降钙素基因相关肽(CGRP)、神经肽 Y(NPY)水平接近对照组，表明四君子汤可以通过调节神经肽水平，改善脾虚证症状[26]。
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2. 系统药理学方法在中医药研究中的应用
2.1 背景
中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶，是历代医家实践经验的总结, 经过千百年来不断的发展创新，逐渐形成了以“整体观”、“辨证论治”、“个体诊治”为精髓的系统的中医药理论体系, 为人类的防病治病作出了巨大的贡献。但由于中医独特的哲学思想与理论体系，各国医生和患者很难理解与接受中医，因此大大限制了中医药向现代化与国际化发展。随着科学的快速发展，中药化学和中药药理学等方面的研究取得了较大的进展，给中药现代化研究提供了良好的环境，在中药有效成分的提取分离、药理作用的研究，一些模糊中医理论概念客观标准的提出等方面取得了一定的进展，使中医理论与西医理论得到了一定的衔接。
中药化学研究主要沿着两条思路进行，一是从中药的功效出发，利用对单一中药或中药复方拆方提取有效成分，发现先导化合物，进行结构修饰或简化，如我国自行开发的青蒿素等；二是在中医药理论指导下，对方剂的君、臣、佐、使配伍，以及整体观念、协同配合等理论的物质基础进行研究。我国中药化学成分研究的方法与技术已从简单的萃取、柱分离延伸到利用超临界萃取、超滤、超声、分子蒸馏、逆流色谱等分离技术；从化学鉴定进入到以核磁共振、质谱、X 射线衍射等现代光谱技术为主导；各种光谱色谱连用技术为中药及复方物质基础的研究提供了便利的条件。然而，每个药材含有多种化学成分，因此对中药及复方的物质基础研究难度非常大。如何判断药物的有效物质基础？如何判断多种中药含同一种化学成分时该成分与全方的药效关系？中药炮制、煎煮过程中对药性物质动态化学变化的影响，是否生成的新复合物？单体化合物体外有效体内效果不佳等各个问题交织在一起，使研究困难重重。
中药药理研究也是中医药现代化的重要方法之一。众所周知，中医药理论是建立在长期经验基础上的高度总结，它在指导中医用药治疗疾病方面做出了不可磨灭的贡献。但是，在中医药现代化的过程中，人们所遇到的一个关键瓶颈就是如何用现代科学语言诠释中医药理论、解释中药及方剂的作用机理，从而赋予中医药在现代意义上的科学内涵。作为解释中药作用的重要手段，中药药理研究经过数十年的努力正在逐步走向成熟，研究的层次包括动物整体水平、器官水平、细胞水平和分子水平等；研究的材料包括粗提取物、有效部位、有效单体化合物以及含药血清、药物原形及其代谢产物等；研究的手段主要采用各种现代药理学研究方法，多年的实践也创造出了一些中医药研究独特的方法，如证的动物模型、血清药理学等，同时吸收了其他学科的先进思维和手段，如计算机、数学、物理学、化学、分子生物学、统计学等，这些不同学科交叉的结果为中药药理的研究拓宽了思路。随着研究的不断深入，人们亦发现了中药药理研究中存在着众多的缺陷和不足，甚至是阻碍中医药现代研究深入的因素。
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第二部分 四君子汤靶点预测
1. 靶点预测方法
1.1 分子数据库的构建
本研究的第一步是构建四君子汤的分子数据库，用于筛选活a性成分。为得到四君子汤药物组分的所有已知或已发表信息，对每味中药进行大量的文献搜索，通过整合公共资源数据库收集四君子汤已知化合物，构建四君子汤分子数据库。
1.2 中药活性化合物的筛选
1.2.1 口服生物利用度预测
在中药研究过程中，由于缺乏合适的药理学特性尤其是口服生物利用度，大多数化合物无法到达特定细胞的蛋白质靶点。另外，由于中药成分的复杂性和药理作用的广泛性，采用实验方法测量中药成分的口服生物利用度非常困难。因此，采用计算方法来预测中药中一个化合物的药理学活性的方法应运而生。王永华教授实验室建立了一个对药物口服生物利用度进行预测的计算机模型OBioavail 1.1[79]。该模型采用多元线性回归方法（MLR）、偏最小二乘法（PLS）以及支持向量机方法（SVM）进行模型构建。这个模型整合了代谢（细胞色素 P4503A4）和转运（P 糖蛋白）信息，由 805 个不同结构的药物和类药分子构成，预测一个化合物进入人体的口服生物利用度，并通过五倍交叉验证以及独立外部验证来检验模型的可靠性。结果表明，SVM 的性能优于 MLR 和 PLS，其训练集的相关系数 R2=0.80，标准估计误差 SEE=0.31。Q2 = 0.72，SEP = 0.22 为 66 个独立的测试集。由于肠道和肝脏的初步萃取率和吸收率为分别为 43%和 44%[80]，在目前的工作中，我们将 OB 的临界值定义为 30%。
1.2.2 类药性评估
药物类药性是指与大多数已知药物具有某一相同的功能基团或是与其有相似的物理特性的一类化合物[81]。类药性在药物开发过程中通常被广泛地用于评估化合物成为药物的可能性。由于每个化合物具有特殊的属性，如疏水性、氢键和分子大小和灵活性特点，是否类似于已知的特定分子药物取决于分子的平衡特性和结构特性。在靶点预测之前，我们利用类药性指数(DL)将那些从化学角度就不适合做药物的化合物筛除，剩下类药化合物。
其中 A 代表新化合物的结构描述符（Dragon），B 代表数据库 Drugbank 中基于 Dragon 软件计算得到描述符的所有 6511 个化合物分子的平均类药性指数。化合物 DL≥0.18（整个相似度的平均值），则认为该化合物与 Drugbank 数据库里药物具有一定的相似性，具有类药性。根据这一方法，我们筛选所有具有类药性的化合物，进行下一环节的研究。
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2. 四君子汤靶点预测
2.1 四君子汤分子数据库的构建
我们通过整合公共资源数据库收集了四君子汤四味药物 510个已知化合物，包括党参 134 个，白术 55 个，茯苓 34 个，甘草 287 个。考虑到肠道细菌可以将苷类水解为苷配基，糖基化合物在糖苷酶水解作用下去糖基化, 这四种草药的糖苷配基也都放入四君子汤的分子数据库中。
2.2 活性成分筛选
OB≥30%且DL≥0.18的化合物即被看作是活性成分，可进行下一步的研究。结果显示，四君子汤中满足条件的活性化合物有52个（见表2-1），每味药物的具体情况如下:
（1）党参中有21个化合物满足DL≥0.18，OB≥30%，这些化合物包括木犀草素（luteolin）、川芎哚（Perlolyrine）、灌木远志酮 A（Frutinone A）、曼陀罗灵 （ Daturilin ）、 黄 豆 黄 素 （ glycitein ）、 11- 羟 基 兰 金 断 肠 草 碱（11-Hydroxyrankinidine）等。
（2）白术中有 7 个化合物满足 DL≥0.18， OB≥30%，这些化合物包括 12-千里光酰基-8-反式白术三醇（12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol）、14- 乙 酰 基 各 里 光 酰 基 -8- 反 式 白 术 三 醇（14-acetyl-12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol）、14-乙酰基-12-千里 光 酰 基 -8- 顺 式 折 术 三 醇（14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol）、3-乙酰氧基苍术酮（3-acetoxyatractylone）等。
（3）茯苓中有15个化合物满足DL≥0.18， OB≥30%，这些化合物包括去氢土莫酸（dehydroeburicoic acid）、茯苓新酸A（Poricoic acid A）、茯苓新酸B（Poricoic acid B）等。
（4）甘草中有9个化合物满足OB≥30%，DL≥0.18。这些化合物包括甘草黄酮醇A（Glycyrrhiza flavonol A）、异甘草黄酮醇（Isolicoflavonol）、光甘草素（Glabrene）、光甘草定（Glabridin）等，他们是已被证明具有生物活性的化合物。
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第三部分 四君子汤实验研究................... 41
实验一 四君子汤对脾气虚模型大鼠的药理作用......41
1.实验材料......................................41
2.实验方法...................................... 42
讨论 ......................................62
1.基于系统药理学方法四君子汤作用靶点的预测 ...... 62
1.1 四君子汤活性成分筛选........................62
1.2 靶点获取与网络构建........................62
2.脾气虚证大鼠模型的评价......................63
3.四君子汤对脾气虚模型大鼠的药理作用 ........... 65
结语...........................................71
讨 论
1. 基于系统药理学方法四君子汤作用靶点的预测
四君子汤是治疗脾气虚证的经典方，由人参（党参）、茯苓、白术、甘草四味药组成。因其药物组成精妙，临床应用广泛，四君子汤一直是历代医家研究的热点。目前对四君子汤研究的方法主要有药味与药量加减拆方、血清药物化学、药效组分指纹图谱等，这些方法未能充分体现中药“多成分、多靶点”协同作用特色，不能有效的揭示四君子汤的作用机制。由于中药中含多种活性化合物，这些活性分子可能打靶到多个生物靶点，这些靶点也可能涉及到多种多样的发病机理，因此在研究药物的作用机制之前，弄清中药中有哪些活性成分非常重要。本研究就是利用系统药理学方法确定四君子汤活性成分、预测作用靶点及揭示分子与靶点及靶点与疾病之间的关系。
1.1 四君子汤活性成分筛选
口服生物利用度预测和类药性评估是药物活性成分筛选的两个重要指标。在药物筛选的过程中，口服生物利用度是药物在机体吸收、分布、代谢、排泄中最重要的药代动力学参数之一，同时也是药物输送到机体血液循环相对量的一个非常重要的指示器，口服生物利用度高的化合物才有可能成为治疗药物，进入到下一步的药物研究开发过程中。药物类药性是用来描述分子数据库里的化合物与Drugbank数据库里所有药物之间的相似情况，在药物开发早期，通常用类药性评估化合物能否成为药物，排除非类药性化合物，节省时间、物力和财力，降低药物研发的成本和失败率。因此，我们利用类药性指数(DL)在靶点预测之前筛除那些不适合做药物的化合物。
本研究通过整合公共资源数据库收集了四君子汤四味药物510个化合物，包括党参134个，白术55个，茯苓34个，甘草287个, 通过类药性评估和口服生物利用度预测，筛选活性成分52个，可以进行下一步的继续研究。
1.2 靶点获取与网络构建
预测活性化合物作用靶点是中药系统药理学研究的关键环节，从整体角度明确化合物与靶点的分布是阐释药物作用机理的一个重要步骤。而对药物作用机制的综合理解需要从系统水平理解药物、靶点和复杂疾病之间潜在的相互作用。因此，我们绘制了四君子汤的分子-靶点-疾病（C-T-D）网络图。通过化合物靶点预测、C-T-D 网络构建，全面系统地阐释化合物、靶点、疾病之间的关联，从网络层面观察药物对疾病的作用机制，理解中药多靶点、多疗效的作用机制。
通过对四君子汤活性成分靶点预测，构建了由 degree≥2 的 25 个候选药物分子和 143 个候选靶点组成的 168 个节点和 507 条边的药物-靶点网络图。在 25个药物分子中，有 17 个分子与至少 10 个靶点连接，143 个候选靶点中有 44 个靶点的 degree 在 4 及以上。通过靶点-疾病预测，构建了 64 个靶点连接到 56种疾病的靶点-疾病网络图，包含 120 个节点和 249 条边，有 249 个靶点-疾病之间的联系，靶点连接的疾病多涉及胃、肝、结肠等器官的炎症、肿瘤等。四君子汤活性成分筛选和靶点预测结果表明，四君子汤四味药物活性成分的作用靶点之间有交叉，如党参、白术、茯苓、甘草的活性成分同时作用于 AR、PTGS2、ACHE 等靶点，党参、白术、甘草的活性成分同时作用于 PPARG、ADRA1A、ADRB1等靶点，药物之间存在潜在的协同效应。25 个候选药物分子的每个分子与 2 个及 2 个以上靶点连接，44 个靶点 degree≥4 以及 64 个靶点中有 27 个靶点对应3 个以上疾病，说明同一药物分子可以作用于不同的靶点、疾病，不同的疾病具有相同的病理变化，可被同一复方治愈。
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结 语
本研究利用系统药理学方法筛选四君子汤的活性成分、预测作用靶点，并通过动物实验，观测四君子汤对脾气虚模型大鼠胃粘膜损伤、免疫功能、胃泌素分泌、抗氧化作用的影响及四君子汤对预测靶点mRNA表达的影响，为全面研究四君子汤的作用机制提供了精确靶点和实验依据。
1.本研究通过采用系统药理学方法对四君子汤进行活性成分筛选和靶点预测，获得四君子汤活性分子 52 个，预测作用靶点 143 个，预测靶点连接的疾病56 种，并通过构建分子-靶点-疾病网络图，系统地分析阐释了药物、靶点、疾病之间的联系，为进一步深入研究四君子汤的作用机制提供了精确的靶点基础。
2.实验研究结果表明，四君子汤全方煎剂能改善脾气虚模型大鼠运化功能、促进胃粘膜修复、调节免疫功能、促进胃肠激素分泌和提高抗氧化作用，证明四君子汤对脾气虚模型大鼠作用有效，在此基础上进一步通过荧光定量 PCR 方法检测，验证四君子汤对预测靶点 PPARG、MAPK1、TP53 mRNA 表达的影响，结果表明四君子汤能调节预测靶点 PPARG、MAPK1、TP53 mRNA 的表达，说明四君子汤全方煎剂对预测靶点的作用与预测的药物分子对靶点的作用一致。
本研究采用系统药理学方法对四君子汤的活性成分和作用靶点进行预测，克服了传统的通过分离、提纯、结构鉴定等过程来确定中药有效成分实验成本高、工作量大、失败率高、进展缓慢等诸多问题，从网络的层面阐释了药物对疾病的干预与影响，为方药的现代化研究提供了新方法、新思路。但由于时间限制，只选择了部分靶点进行实验验证，在今后的研究中，将扩大靶点验证范围，进一步深入探讨四君子汤的作用机制，并通过病证结合、方证相应的方法，探索四君子汤主治证脾气虚证的生物学基础，丰富中医理论的科学内涵。
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参考文献（略）