1绪论
1.1刺政果研究进展
1.1.1刺玫果化学成分的研究概况
山刺玫为蔷藻科蓄薇属植物，其果实为刺玫果，又名野蔷藻果[21]。《中国植物志》中记载，山刺玫在我国境内多地都有分布，在境外的朝鲜、蒙古南部等地也有生长⑴。在《中药大辞典》中，对刺玫果的外形描述为球形或卵圆形，干燥后，果实外壁坚实且质脆，果实味道酸甜，内含约24枚带毛域的种子[2]。《东北常用中草药手册》和《黑龙江中药》两部著作中，记载了刺玫果能够健脾理气、养血调经。由于刺玫果多数生长在野生环境下，所受到的污染小，并且口味酸甜，是纯天然的食品，民间很早就开始采食刺玫果，或用来泡茶、泡酒刺玫果具有很高的营养价值，是因为果实内营养成分含量高而随着对其所含化学成分的进一步研究，刺玫果的许多药理作用也正逐步受到人们的关注，因此，刺玫果的药用价值也将会得到广泛的开发和利用。
1.1.1.1矿物元素
通过不同的检测方法，有28种矿物元素分别在刺玫果的干燥果实和新鲜果实中被检测出，刺玫果中含有大约14种矿物元素如钾、韩、憐、钠、镁、锌、硒、铜、碑、镍、铬、铁、猛和钼为人体所必需，而这些人体所需的微量元素在含量上也有所不同，其中，铬、镇、砷的含量较少，梓和硒的含量较高，尤其是硒元素的含量，高于许多常见的硒元素含量高的动物和植物。
1.1.1.2维生素类
刺玫果中各类维生素的含量十分丰富，尤其是维生素C的含量，能达到1274-2264mg/lOOg,与维生素C含量高的水果相比，其含量远高于前者。
1.1.1.3氨基酸
人体所必需的8种氨基酸在刺玫果中都能被检测到，除此之外，另有10种不是人体所必需的氨基酸，有研究指出，对刺玫果种子进行脱色素处理后，其中的氨基酸种类少于未处理的刺玫果果肉和种子。
1.1.1.4脂肪油
刺玫果中所含的脂肪油类成分多存在于刺玫果果实的种子中，通过对实验提取的脂肪油进行种类和含量的测定后，共可以检测到6种脂肪酸，其中3种饱和脂肪酸含量为6.3%,剩余92.41%为不饱和脂肪酸[12]。
刺玫果果皮中多酷类提取物的还原力强于维生素C，对超氧阴离子自由基、过氧化氧自由基和轻基自由基均有一定程度的清除能力，且作用也都强于维生素ct4i]。刺玫果中所含黄酮类物质可降低菜籽油和猪油中的过氧化值，表现出较强的抗氧化性[42]。通过ORAC法测定刺玫果不同提取物的体外抗氧化活性，研究结果表明刺玫果的乙醇提取物和水提取物具有较好的抗氧化能力[43]。有研究将刺玫果种子和果肉用不同极性溶剂进行分别萃取，对所得萃取物进行体外抗氧化实验，结果显示，果肉和种子的不同萃取物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和经基自由基均有一定的清除能力。刺玫果不同提取物对HepG2细胞的氧化应激损伤有一定的保护作用，研究结果显示刺玫果提取物尤其是多酷类提取物在细胞水平上有一定的抗氧化能力[45]。
1.2鞣质的研究进展
鞣质(Tannins),许多学者也称其为单宁，广泛分布在蔷薇科、蓼科、茵草科等中草药中。鞣质在化学结构上，可分为可水解鞣质、缩合鞣质和复合鞣质三类。鞣质由于结构上具有较多酌轻基，极性较强，因此在水、甲醇、乙醇、丙酮中的溶解度较大，在乙酸、氯仿、石油酸等极性小的溶剂中溶解度较小，适量的水可增加鞣质在有机溶剂中的溶解度。
缩合_质在植物体内是黄烷-3-醇及黄烷-3,4-二醇的聚合体，在酸、碱、酶的作用下不能水解。缩合鞣质在自然界中的分布较可水解鞣质广泛，天然鞣制大多属于缩合鞣质。在植物的果实、种子和树皮等部位均有缩合鞣质分布。由于缩合鞣质的缩合度大，多数情况易形成复杂的混合体，因此在分离、精制和结构测定上，对于缩合鞣质都变的较为困难。目前在中药中分离得到的缩合鞣质多为二聚体、三聚体和四聚体，也有部分五聚体和六聚体[54]。复合樣质是可水解鞣质与缩合鞣质的结合体，它们在结构上是由可水解鞣质部分与黄烷醇缩合而成的，因此在性质上与前两种鞣质一致。
1.2.2鞣质的药理活性和应用现状
鞣质的化学结构决定了其独特的药理活性，由于鞣质结构复杂、纯化困难，因此在早期药物的提取纯化过程中，鞣质往往被当做杂质除去，因此对于它的药理作用的研究并没有受到学者的关注，近年来随着提取方法和分析设备的不断改进，针对鞣质单体的研究逐渐增多，由此对于其药理活性和作用机理的研究也随之发展起来。
体外实验研究均证明了鞣质具有良好的抗菌、抗病毒作用，然而揭示鞣质抗病原微生物的机制则更有利于推进鞣质类抗菌药的研制，有研究曾对鞣质的抗菌机理进行过探讨，结果证明鞣质可以与蛋白发生反应，形成一种稳定的水溶性化合物，从而直接破坏细菌的生物膜来发挥抗菌作用[60，实验利用琼脂扩散法对叙利亚枣种子精油中所含鞣质类成分抗菌活性进行了研究，结果显示其对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺氏菌、绿脓杆菌都有一定的抑制作用，而且对于革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌，作用机理可能是鞣质成分作用于细菌的细胞壁和DNA而起到抑菌作用[61]。石榴皮餘质提取物抑制单核细胞增多性李斯特菌的MIC值为5 mg/ml,在鞣质浓度为2.5 mg/ml时对单核细胞增多性李斯特菌进行培养，细菌的prfA、ink Ahly转录水平分别降低了 17倍、34倍和28倍，说明石榴皮鞣质能够降低细菌三种病毒基因mRNA的水平，从而起到抑菌作用[62]。植物中的鞣质类成分可抑制牙齿致龋菌的生长和點附，使蛋白凝固从而减轻牙髓细胞所受到的脂多糖的毒性作用，减轻口腔淸疡疼痛，促进馈疡面愈合[63]。红酒中的革柔质类成分，白藜声醇和一些黄酮类成分是抗菌的主要活性物质，在红酒浓度为2%时对金黄色葡萄球菌生物膜结构的影响超过了 90%，在浓度为0.1%时对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜结构的影响超过了 50%，但对于细菌的生长却没有抑制作用，因此推断其机制并不是直接的杀菌作用，而是对细菌生物膜功能的影响[64]。诃子鞣质影响白色念珠菌生物膜的形成，并对成熟期的白色念珠菌有生长抑制作用，但其抑菌机制可能是通过非调亡途径实现的[65]。
2刺玫果果实不同部分鞣质成分的提取和含量测定
刺玫果中所含的主要活性成分能够抗氧化，延缓衰老，提高免疫力，抗辖射，预防和治疗动脉粥样硬化等心血管疾病，治疗糖尿病等。目前刺玫果己被开发成药食两用的植物，以刺玫果为原料做成的药品和食品己经研发面世。经查阅和研究文献可知，对刺玫果中樣质成分的研究较少，并且针对刺玫果果实不同部分難质成分的研究也较少。为了能进一步了解刺玫果果实不同部分的鞣质含量，更好的开发和利用刺玫果资源，本实验对刺玫果不同部分￥柔质成分进行了提取并对其中的鞣质成分做了进一步研究。
2.2实验部分
2.2.1实验材料
本实验所用材料于2011年10月采自帽儿山，样品经哈尔滨商业大学药学院金哲雄教授鉴定。
2.2.4刺攻果果实不同部分中鞣质的提取
将刺玫果果实的果肉和种子两个部分进行分离后，对两部分样品分别进行粉碎，过40目蹄，根据文献对于刺玫果轉质的提取方法[39],使用8倍量70%丙酮作为提取溶剂，分别浸泡两种样品12 h后，利用超声提取法室温条件下超声提取1h，将提取液抽滤，减压回收丙酮后，依次用有机溶剂乙醚、乙酸乙醋和水饱和正丁醇对提取液进行萃取，每种有机溶剂共萃取三次，可得到三种萃取物I、II、III。分别减压回收乙酸乙醋层和水饱和正丁醇层中的有机溶剂，浓缩后分别得到刺玫果果肉和刺玫果种子乙酸乙酯层与水饱和正丁醇层浸膏。
用分析天平精确称量50 mg的没食子酸对照品，将其放置于100 mL的棕色容量瓶中，加适量蒸馏水溶解后，定容到刻度线，摇匀，从100 mL棕色容量瓶中精密量取5mU容液，放置于50 mL掠色容量瓶中，用蒸馆水定容到刻度线，摇勾，将配制好的对照品溶液，放入4°C冰箱中保存。
从配制好的对照品溶液中精密量取0.5 mL、1.0 mL. 2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL,分别放置在25 mL的棕色容量瓶中，每一个棕色瓶中再各加入隣银鹤酸试液1 mL,每一个棕色瓶中依次加入11.5 mL、11 mL、10 mL、9 mL、8 mL的蒸馆水，用29%碳酸钠溶液将每一个棕色瓶定容至刻度线，摇匀，需要静置30 min,以不加对照品溶液为空白，在760 nm波长处用紫外可见分光光度计测吸光度，而后以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出标准曲线。
精密称量刺玫果果肉和种子提取物浸膏，用蒸馏水溶解后，将其放入到250 mL棕色容量瓶中，然后加蒸谐水定容至刻度线，摇勾，再精密量取250 mL容量瓶中溶液10mL,放入100mL棕色容量瓶中，加蒸馆水定容至刻度，摇勾，得到供试品溶液。
不被吸附的多紛的测定方法：分析天平精密称量0.6 g的干酪素，放入带塞的锥形瓶中，再精密量取25 mL的供试品溶液加入锥形瓶中，盖上塞子，放到30℃的水浴锅中水浴保温1 h，时时对锥形瓶进行振摇，之后取出冷却，摇勾后进行过滤，将初滤液弃去，精密量取2 mL滤液，放入到25 mL的棕色容量瓶中，棕色瓶中加入憐银鹤酸试液1 mL，再加蒸馆水10 mL，用29%碳酸钠溶液将棕色瓶定容至刻度线，摇匀，需要静置30 min,在760 nm波长处用紫外可见分光光度计测吸光度，根据标准曲线算出供试品溶液中没食子酸的量(mg)。截质含量为二者之差。
3刺玫果果实不同部分鞣质成分的体外抗肿瘤作用............23
3.1引言....................................23
3.2实验部分...............................23
3.2.1实验瘤株...............................23
4刺玫果果实不同部分鞣质成分的体内抗肿瘤作用............30
4.1 引言...............................30
4.2实验部分...............................30
4.2.1实验动物...............................30
4.2.2实验仪器...............................30
4.2.3实验药品与试剂...............................30
4.2.4实验方法...............................30
4.3实验结果与分析...............................30
5 讨论...............................43
5讨论
己有研究表明刺玫果中鞣质可能具有预防肿瘤的作用，因此本文就其抗肿瘤活性进行了初步的探究。已知的研究多数将刺玫果果实的不同部分混合使用，若刺玫果果实的不同部分在抗肿瘤活性上存在差异，则不利于后续评价和确定刺玫果果实鞣质的抗肿瘤活性部位。因此在研究抗肿瘤活性之前，本研究对刺玫果果实的果肉和种子两部分进行了分离，并对其中的鞣质成分进行了分别提取，以没食子酸为对照品，将两部分提取物进行了鞣质含量测定。
按照已有文献对于刺玫果鞣质的提取方法，分别得到了刺玫果果肉和种子的難质乙酸乙酯、正丁醇提取物。先将四种提取物通过干酪素法进行含量测定，测定结果表明在刺玫果果肉和种子中，餘质含量存在差异，且不同的溶剂提取物難质含量也有所不同，其中以刺玫果果肉乙酸乙酯提取物中鞣质含量最高，其次为刺玫果种子乙酸乙酯提取物，而在正丁醇提取物中，果肉的鞣质含量低于种子。由以上结果分析，乙酸乙酯可较好的纯化刺玫果果实轉质粗提物，正丁醇可将不溶于乙酸乙酯的那部分鞣质从粗提物中分离出来。通过HPLC图谱可知，刺玫果果肉的丙酮粗提物中没食子酸特征峰较明显，但杂质也较多，经过乙酸乙酷萃取后，在保留了没食子酸特征峰的基础上，杂质的含量显著降低，之后再经过正丁醇萃取，提取物中仍有樣质成分，但其中的杂质较乙酸乙酯萃取物有所增加。两种检测结果均验证了在刺玫果果实的不同部分中，乙酸乙酯提取物鞣质含量高于正丁醇提取物，而在乙酸乙酯提取物中，又以果肉中鞣质含量最高。
测定肿瘤细胞的增殖活力在药物的抗肿瘤作用评价中是不可或缺的，是蹄选新药的基本方法，并且为药物的体内和临床研究提供先期的原始数据。细胞增殖活力的检测方法很多，它们基于不同的细胞机能来实现，例如线粒体酶活性、细胞膜渗透性、ATP的生成、细胞的摄取活性等。MTT法是基于细胞线粒体酶活性的检测方法，在活细胞中，MTT主要被NADH还原为不可溶的紫色甲瓒，甲璜在细胞中会形成紫色晶体，加入有机溶剂DMSO可用来溶解晶体，通过检测晶体溶解后溶液的吸光度值来间接衡量实验细胞的存活数量。
结论
本文对刺玫果果肉和种子两部分所含鞣质进行了分别提取，并对提取物的抗肿瘤活性做了初步研究，研究结论如下：
本实验将刺玫果的果肉和种子两部分分离，用8倍量70%丙酮对两部分药材分别进行提取，用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到鞣质含量较多的乙酸乙酯层和正丁醇层，并根据《中国药典》2010年版一部附录XB，测鞣质的含量，测定结果为刺玫果果肉乙酸乙酯层浸膏中鞣质占53.58%，刺玫果果肉正丁醇层浸膏中鞣质占13.27%。刺玫果种子乙酸乙酯层浸膏中鞣质占48.32%，刺玫果种子正丁醇层浸膏中鞣质占23.43%。高效液相色谱法的测定结果为，在刺玫果果肉的乙酸乙酯层提取物中，没食子酸占浸膏的1.20%，在刺玫果果肉的正丁醇层提取物中，没食子酸占浸膏的0.20%。在刺玫果种子的乙酸乙酯层提取物中，没食子酸占浸膏的0.35%,在刺玫果种子的正丁醇层提取物中，没食子酸占浸膏的0.12%。经方法学考察，干酪素法和HPLC法都有很好的精密度、稳定性、重复性和准确度。
体外实验研究刺玫果果实不同部分鞣质对人肝癌细胞HepG2和人胃癌细胞SGC-7901增殖活力的影响。在测定中，刺玫果果实不同部分鞣质对两种细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。果肉乙酸乙酯层的增殖抑制作用在四种提取物中最为显著，其次为种子乙酸乙酯层提取物，而果实和种子两部分的正丁醇层提取物，其增殖抑制作用均明显低于乙酸乙酯层。通过体外抗肿瘤实验结果可知，刺玫果果肉和种子的乙酸乙酯层抗肿瘤作用强于正丁醇层，故在接下来的实验中，选择果肉和种子的乙酸乙酯层提取物进行体内抗肿瘤研究。体内实验通过建立肝癌H22荷瘤小鼠模型，研究刺玫果果实不同部分鞣质的抗肿瘤活性。由结果可知，果肉和种子的乙酸乙酯层鞣质提取物均可不同程度抑制肿瘤的生长，其中以果肉乙酸乙酯提取物作用最强，高剂量的果肉乙酸乙酯提取物抑瘤率为54.67%。提取物各剂量组的脾指数和胸腺指数与模型组相比均有升高，对荷瘤小鼠的免疫功能可起到促进作用。刺玫果不问部分乙酸乙酷层提取物可提1?荷瘤小鼠体内SOD、CAT活力，降低MDA含量，从而提尚荷瘤小鼠体内抗氧化系统活性，降低脂质过氧化反应。相关性分析结果显示，刺玫果不同部分乙酸乙酯层提取物可增强免疫器官功能和抗氧化活性，这与其发挥抗肿瘤作用联系密切。
通过以上实验，说明在刺玫果果肉和种子中，鞣质成分具有抗肿瘤活性，而以刺玫果果肉的乙酸乙酯提取物作用最显著，具有较好的抗肿瘤开发潜力。
参考文献（略）