引 言
长期以来由于我国中药质量控制整体水平相对落后，质量标准体系很不完善，中药质量难以得到有效控制，伪劣药品屡见不鲜，严重影响到中药的临床疗效和用药安全。中药质量标准是进行中药质量控制和评价的法定依据，我国中药质量标准经历了从无到有、从简单到逐步完善的过程，现在依旧在不断摸索之中。从历年的《中国药典》看，1985年前的质量标准包括完全凭经验的外观形态鉴别以及显微鉴别，没有定量指标，缺乏专属性鉴别项目。1985年后，中药质量标准的发展方向转为微观内在成分的监测，开始用化学和仪器分析方法对中药成分进行鉴别和测定。2005版《中国药典》进一步加强了中药成分的鉴别和测定，其中用高效液相色谱法进行含量测定的品种有479种，计518项，是2000年版的3倍多。最新一版的2010版《中国药典》收载品种的新增幅度和修订幅度均为历版最高，其中液质联用等现代分析技术也被收载，但此技术的应用范围还不广泛，有待扩大[1]。
但是该方法用于中药质量标准的建立还存在缺点，因为紫外检测器的专属性不强，对于单个色谱峰仅能提供保留时间和紫外图谱等信号，其主要依靠与标准物对比来判断未知物，通过紫外检测器得到的每一个色谱峰只能说是紫外吸收和极性相似的化合物，在含量测定中，紫外检测器的缺点是有紫外吸收的组分如果在色谱上不能完全分离，则会产生检测信号的叠加，影响检测结果。由于中药材质量的特殊性和复杂性，且中药样品处理一般采用回流法、超声法、索氏提取法等，比较简单，因此无法完全保证每一个色谱峰是同一类化合物更不能确定就是同一个化合物，这就影响了检测结果的准确性。对于紫外吸收为末端吸收的皂苷类物质，由于中药中的大多数成分都有末端吸收，因此想要准确定量，就要求各个化学组分在色谱上完全分离，但这点很难做到，因此得到的定量结果更不准确，而对没有紫外吸收的化合物的检测则要通过其它途径进行分析，此外，紫外检测器对未知成分所能提供的结构信息也相当有限。本研究采用液质联用技术可以很好的解决这一问题，质谱检测器是一种高灵敏度的检测器，用提取离子色谱图选择某一化合物的特征离子进行准确定量，其优势在于色谱峰不需要完全分离就能够准确定量，检测具有专一性，而色谱其它检测器不具有。本研究采用高效液相色谱法对紫外检测器和质谱检测器进行适应性比较，分析比较两种检测器所测得的含量测定结果的准确性。如果采用紫外检测器测得的结果的准确度很高，可以直接采用紫外检测器进行化合物的分析，省时方便，如果准确度不高，则直接采用紫外检测器所得的结果是不准确的，可以通过提取离子流图找到所测成分与紫外色谱峰大小的比例关系，也可通过紫外检测器得到我们想要的结果。这对于一些有毒成分、微量成分的检测意义更为重大。
目前，液质联用技术已广泛应用于中药化学成分的定性定量中[2~6]，但尚未见采用提取离子流图来判断紫外检测器与质谱检测器所得测定结果准确度的报道。本课题之前采用高效液相色谱法（二极管阵列检测器）对不同产地、不同采收期、不同贮存期的黄芩中的黄酮类化合物进行了分析，接下来我们采用液质联用技术对其进行准确定量并与单纯使用液相进行比较，为进一步完善黄芩的质量标准提供依据。此外，本实验选择中成药三黄片中的盐酸小檗碱、大黄酚、大黄素及黄芪中的黄芪甲苷等对该实验进行方法验证，该方法也为其他中药质量标准的完善提供借鉴。另外，本研究建立了黄芩及三黄片中部分黄酮及蒽醌类化合物的谱库，并验证了谱库检索结果的可信度，为中药中化合物的快速识别提供一种有效的方法。
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第一部分不同采收期黄芩中黄酮类成分的研究
前 言
黄芩（Scutellariae Radix）来源于唇形科植物黄芩（Scutellariabaicalensis Georgi）的干燥根，为中医临床常用中药，其道地药材主要分布于河北、山西北部、内蒙中东部和东北三省[7]，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，用于湿温、暑湿胸闷呕恶、肺热咳嗽、高热烦渴、胎动不安等[8]。中药材的品种、产地、气候及土壤条件之间的差异即采收期的不同会造成其内部的化学组分及含量也有所不同，从而导致临床上用药的药效差别，因此采收期是影响中药材产量与质量的重要环节[9]，不同采收期影响黄芩药材的质量。黄芩主要的有效成分为黄酮类成分如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、白杨素、千层纸素 A 等[7,10]，本实验采用目前应用广泛的液质联用技术对不同采收期的黄芩进行研究，以黄芩中 6 个黄酮类化合物作为含量测定指标，为确定黄芩药材最佳采收期提供参考。
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材料与方法
1 实验材料
1.1 仪器
Agilent6310系列液相色谱-质谱联用仪（安捷伦公司），6310质谱仪，1200Series高效液相色谱仪；HC-2062高速离心机（科大创新股份有限公司）；MettlerAG245分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；KQ-700型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Thermo超纯水机（Smart2Pure）。
1.2 材料
药材：栽培黄芩药材采自赤峰与山东地区，其中赤峰黄芩春秋两季各三个年份，分别为一年生、二年生、三年生，山东黄芩秋季两个年份，分别为一年生、二年生，且每批黄芩选自同一地块各采集 10~20 株。药材产地由课题组人员亲自考察且药材由中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室的周世良研究员鉴定为正品黄芩。对照品: 黄芩苷（批号 715-9506）、黄芩素（批号 111595-200604）、汉黄芩素（批号111514-200403 ）均购自中国药品生物制品检定所，汉黄芩苷（批号20090319）、白杨素（批号 090518）、千层纸素 A（批号 20091124）均购自上海顺勃生物工程技术有限公司；甲醇、乙腈（Fisher Scientific 公司）为色谱纯；甲酸、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。
2 测定方法
2.1 LC-MS 条件
2.1.1 LC条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；体积流量0.2 mL·min 1；进样量2 μL；柱温25 ℃；检测波长276nm；流动相为0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B），平衡时间为10 min，梯度洗脱，洗脱程序如下：0~10 min，18%~20% B；10~18 min，20%~25% B；18~30 min，25%~30% B；30~40 min，30%~40% B；40~60 min；40%~60%B。
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第四部分 谱库的建立、检索与应用
前言··················39
材料与方法·························39
结果···························41
附图····························44
附表··························46
讨论··························46
小结··························47
参考文献························48
结论···························49
第四部分谱库的建立、检索与应用
讨 论
为获得好的质谱电离方式，本研究分别于正负离子模式下进行扫描，以选择最优的离子扫描模式来建立谱库。在选择建立的谱库进行检索时，不同参数匹配的权重不同，会影响最后匹配的结果和匹配度。ESI 源与APCI 源，各自适合不同类型的化合物。
从目前的研究结果看，还存在一些问题需要进一步思考和解决：第一，根据 LC-MS-DS 的检索结果可初步确定未知化合物的归属，但还需要结合对照品和 MS/MS 裂解规律进行准确的结构鉴定，为其应用于天然产物快速鉴定和高效分离奠定基础。第二，LC-MS 采集的信号中存在高背景噪音，其主要来源于仪器中的电子元件和流动相中有质谱响应的有机试剂（如甲酸、乙酸铵等）或其他杂质。这些噪音会大大提高样品总离子流图的基线，并对推断样品中可能的组分数造成干扰，因此前期的样品 LC-MS 分析条件的优化非常重要。第三，不同厂家和型号的质谱仪采集的质谱谱图中碎片离子峰的丰度和种类都会存在不同程度的差异，因此深入研究液质检测的相关参数对谱图采集结果的影响，并引入适当的化学计量学评价方法对于 LC-MS-DS 的推广应用具有积极意义。第四，本谱库目前仅能在 Agilent 工作站上操作使用。下一步将研究各种不同类型的液质联用仪器的数据存储格式，应用计算机知识，构建兼容性好的天然产物LC-MS-DS。
本研究应用 HPLC-ESI-MS/MS 技术，构建了具有较强检索功能的化合物 LC-MS-DS。本文通过黄芩、三黄片实例验证，表明所构建的谱库检索结果具有较高的可信度，可作为一种中药中化合物快速鉴定的方法，具有很好的应用前景。
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结 论
1. 春季和秋季采收的黄芩中主要黄酮类化合物含量不同，不同采收年限采收的黄芩中主要黄酮类化合物含量也不同，本实验可以初步反映不同采收期黄芩的质量，可以为制定黄芩药材的采收期提供参考。
2. 随着贮藏时间的推移，黄芩中主要黄酮类化合物含量整体呈下降趋势。本实验可以反映不同贮藏期黄芩的质量，可以为制定黄芩药材的贮藏期提供依据。
本研究基于液质联用技术对不同产地、采收期、贮藏期的黄芩进行物质基础分析，可初步确定不同产地、采收期、贮藏期的黄芩物质基础有差别，接下来会采用分辨率更高的质谱进行无歧视分析，即对黄芩样品中大小分子信息全部采集，经过 MPP 软件（解卷积软件）进行处理、分析，通过建模与通路分析，建立确定品种、产地、采收期黄芩药材的标准谱库，用以区别其它品种、产地及采收期的黄芩药材。
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参考文献（略）