引 言
马钱子多以复方入药，但是要达到减毒增效的目的，必须合理配伍，这是目前亟待解决的重要课题。因此本课题在中医药理论指导下，以临床应用为依据，选择马钱子配伍白术，通过观察其不同配伍剂量组对佐剂关节炎（AA）大鼠足肿的影响，并测定用药后大鼠滑膜中 TNF-α 及细胞凋亡因子 Fas、FasL、Bcl-2、Bax、p53、Caspase3含量水平的变化，以及对免疫器官胸腺和脾脏的影响，从而探讨马钱子配伍白术治疗RA 的抗炎机理，寻求马钱子配伍白术的最佳比例，进一步阐释马钱子配伍白术的配伍意义，为临床合理应用治疗 RA 提供科学依据。
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理论研究
RA 是以累及小关节为主的多系统性炎症性的全身免疫病。RA 主要侵犯四肢小关节，呈对称性发作，临床表现为受累关节变形、肿胀、疼痛、功能下降，病变呈反复性、持续性发作。目前虽然治疗本病方法很多，但因远期疗效不确切，副作用较大，临床疗效并不理想。
一、对 RA 的认识
（一）中医学对 RA 的认识
1. 传统中医学对RA的认识
祖国医学的医籍中没有RA这个病名，本病属中医学之“痹证”、“历节”、 “白虎病”等范畴。关于痹证最早在《内经》即有论述，如《素问·痹论篇》中指出：“荣者，水谷之精气也 卫者，水谷之悍气也 逆其气则病，从其气则愈，不与风寒湿气合，故不为痹”。
《内经》中已根据所感邪气的偏盛，将痹证分为风痹、寒痹、湿痹、热痹。但对于热痹的成因并没有详细的论述，后世医家顾松园在《顾氏医镜·痹》中以“邪郁病久，风变为火，寒变为热，湿变为痰”，来描述其病因。可见热痹形成多是由于素体阳盛或阴虚有热，感受外邪之后，邪从热化；或因风寒湿痹，日久不愈，邪留经络关节，郁而化热，以致出现关节灼热红肿疼痛。正气不足外邪乘虚而入是诱发痹证又一因素，如《灵枢·百病始生》所云: “风雨寒热不得虚，邪不能独伤人。卒然逢疾风暴雨而不病者，盖无虚，故不能独伤人。此必因虚邪之风，与其身形，两虚相得，乃客其形。”当机体正气不足时，外来邪气则乘虚侵袭肢体关节肌肉，使经脉闭阻不通，而发痹症。在临床上引起正虚的原因多为先天禀赋不足、劳役过度、大病、久病、产后、饮食失调及外伤等。气血不仅是构成和维持人体生命活动的基本物质，也是正气的重要组成部分，它运行于全身，固护腠理濡养筋肉关节。当气血不足时，会导致肌肤失养，腠理空虚，卫外不固，外邪乘虚而入，阻塞气血经络，瘀痰内生，留注于经络、关节、肌肉，而致本病。还会造成风寒湿热之邪侵入人体后，无力趋邪外出而逐渐深入，留连于筋骨血脉，使气血运行不畅而成痹证。以上可见正气亏虚、机体失养、抵抗能力下降为发病之本，风寒湿热侵袭为发病之标，故本虚标实是痹证的发病特点。就其病位来说，其标在经络、筋肉、关节，其病之本在肝、脾、肾。针对痹证的发病特点,历代医家采取了固本培元、增强机体的抵抗力治其本，祛风散寒除湿、活血化瘀止痛治其标的治疗原则。
中医还认为痹证发生的主要病机是多种原因导致的局部血行不畅，脉络阻滞不通，并在疾病的发展过程中进一步产生新的病理性产物瘀血和痰浊。如清 王清任《医林改错》中也有“瘀血致痹”之说。导致痹证夹瘀的原因有很多，无论风寒湿邪或正气不足都可导致瘀血的发生。瘀血既是痹证病变过程中的病理产物，又会形成新的病因相互影响，缠绵难愈，日久则成顽痹。痰浊也是痹证病变过程中的病理产物，在痹证的发展过程中由各种原因导致的水液输布障碍，聚湿成痰，留窜骨节经络，凝而为痹。痹证日久变生痰浊与瘀血，相互纠结，气血互伤，使痰瘀互结，胶着于关节，闭阻经络血脉，并使关节、皮肤、肌肉、筋骨失于濡养，造成关节肿大，变形，疼痛剧烈，皮下结节，肢体僵硬，麻木不仁，其疾病顽固难愈。总之，痹证发病的病机较为复杂，病情缠绵。其治疗关键是权衡好扶正与驱邪之间的关系，应标本虚实兼顾，扶正祛邪并用，方可取得较好效果。
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二、对马钱子的相关研究
（一）祖国医学对马钱子的认识
马钱子有较大毒性，一般来说，成人1次口服约5～10mg士的宁可致中毒,30mg可致死亡，幼儿口服5mg即可致死[18]。马钱子的中毒机制主要是通过脊髓兴奋人体的反射功能，调节大脑皮层兴奋性和抑制性，使横纹肌、平滑肌和心肌的张力增加，呼吸功能减弱，最终导致强直性惊厥，呼吸麻痹而致死。
影响马钱子毒性的因素大致有：
1.炮制：有研究表明，马钱子炮制后与生品相比LD50可下降48.5%～52.2%[19]。由此可见炮制质量对马钱子的减毒有着重要影响。尽管炮制方法有砂烫、油炸、绿豆煮、甘草水或童便浸等多种，但目前仍以砂烫法较为常用。
2.配伍：马钱子配伍应用较多。以马钱子为主的代表方如《医宗金鉴》的八厘散，《医林改错》的龙马自来丹等。如果配伍不当，不仅药效降低，还可能增加毒性，适得其反。经验用药及实验研究显示，麝香、延胡索可增加其毒性，甘草、生地黄和赤芍对马钱子有减毒作用。
3.剂量：马钱子的治疗量与中毒量十分接近，且透皮吸收好，故临床用药必须谨慎小心，严格掌握其用法用量，一般应从小剂量开始逐渐加量，外用时也不可过量。因马钱子毒性在体内具有蓄积性的特点，应每隔 20 天左右为一周期停药 3 天。这样既可以保证疗效也可以预防马钱子中毒。
方由制马钱子、 白术等组成，言其“治偏枯、 痹木诸证” 。该书根据胃病的特点，还专门拟定方药，用炒白术四两， 制好马钱子一两，二味如法配丸，按量服用，治疗脾胃虚弱疼痛，饮食减少，身体羸弱者， 并称马钱子为“健胃之妙药” 。又云:“若少服之，但令胃府蠕动有力，则胃中之食必速消 由斯知马钱子健胃之功效迥异乎他药也。” 方中白术味甘，则可缓解马钱子苦温燥烈之毒性，同时有止痛之效，如《五十二病方》 有用白术入复方，以治金伤疼痛的记载；《神农本草经》、《本草纲目》 皆载白术“主寒湿痹， 死肌痉疽”。现代医家陈双全等用制马钱子 3g，白术 15g 等自制通痹汤治疗 RA，疗效好且无马钱子中毒现象。
如表 1 和图 1 所示，模型组大鼠于造模后第 4h 出现足跖肿胀后，12d 足跖肿胀达到高峰，16d 左右随后开始下降。与模型组相比，马钱子配伍白术 1:12、1∶18、1:24煎剂组在 16（dP<0.01）均能显著减轻大鼠足跖肿胀程度；马钱子配伍白术 1∶12、1∶24煎剂组在第 20d 均能有效减轻大鼠足跖肿胀程度，尤其马钱子配伍白术 1∶24 极为明显（P<0.01）；马钱子配伍白术 1:12、1∶18、1:24 煎剂组在 24d（P<0.05）均能有效减轻大鼠足跖肿胀程度；马钱子配伍白术 1:12、1∶18、1∶24 煎剂组均在第 28d 减轻大鼠足跖肿胀程度，尤其是马钱子配伍白术 1:24 煎剂组极显著（P<0.01）；马钱子配伍白术 1∶18、1∶24 煎剂组在第 32d 均能明显减轻大鼠足跖肿胀程度（P<0.01）。由此可见，在整个实验过程中马钱子配伍白术 1∶18、1∶24 煎剂组减轻大鼠足跖肿胀程度明显优于马钱子单煎剂组与白术单煎剂组。
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实验研究.............................................................. 12
一、马钱子配伍白术对 AA 大鼠抗炎作用的影响 ............ 12
（一）实验材料 ..................................... 12
（二）实验方法 .................................................... 13
（三）统计方法 .....................................13
（四）实验结果 ..................................... 13
讨 论............................................................. 35
一、马钱子配伍白术对 AA 大鼠抗炎作用的药效学观察 ..................... 35
二、马钱子配伍白术对 AA 大鼠炎性细胞因子 TNF-α 的影响........ 36
三、马钱子配伍白术对 AA 大鼠细胞凋亡因子的影响 ........ 37
四、马钱子配伍白术对 AA 大鼠细胞凋亡传导通路的影响 .... 38
结 语............................................................. 40
讨 论
一、马钱子配伍白术对 AA 大鼠抗炎作用的药效学观察
（一）对 AA 大鼠足跖肿胀的影响
由于RA病因尚不明确，变证较多，病情复杂，目前临床尚缺乏预防措施与根治本病的方案。在治疗上主要以减轻或消除由血管翳侵袭造成的关节软骨和骨组织破坏，预防和恢复关节功能，从而提高患者的生活质量。通过对造模后 AA 大鼠原发性足跖肿胀的观察发现，模型组在致炎后 4h 开始出现造模部位的关节肿大，表现为局部关节出现红、肿、热、痛，并于第 12d 达到高峰。在给药第 16d 后各组大鼠的造模关节肿胀度开始出现不同程度的下降，在整个治疗过程中马钱子配伍白术 1:24 较其它各组的抗炎效果较为明显。综合分析，可以看出马钱子配伍白术能明显的抑制 RA 的炎症反应，说明配伍用药效果更好。本实验观察证实远期疗效马钱子配伍白术1:24煎剂组的抗炎作用优于马钱子配伍白术1:18煎剂组。
通过观察 AA 大鼠继发性足跖肿胀发现，模型组继发性炎症反应开始出现在 18h后，并与第 12d 达到高峰，造模大鼠的对侧关节开始出现红、肿、热、痛症状，并遍及整个脚趾，部分大鼠耳和尾部可见红斑和炎性小结节等关节外表现。在给药第 16d后各组大鼠的造模关节对侧肿胀度开始出现不同程度的下降，其中马钱子配伍白术1:24 煎剂组对比其它各组抗炎效果较为显著，对 AA 大鼠继发性足跖肿胀治疗效果较好。
TNF包括TNF-α和TNF-β，其中TNF-α通过抗Fas抗体直接参与类风湿关节炎的滑膜细胞凋亡，是维持机体内部免疫系统稳定不可缺少的免疫调节因子，而其失衡将会抑制细胞凋亡信号的敏感性，导致滑膜增生和软骨破坏。TNF-α还通过上调金属蛋白酶（MMP）来抑制类风湿关节炎滑膜纤维母细胞的活性，从而影响RA滑膜细胞的正常凋亡。除此之外，TNF-α与IL-1的作用十分相似，它不仅能抑制软骨中蛋白多糖的吸收导致软骨的降解破坏，也能刺激滑膜细胞分泌多种致炎因子促进成纤维母细胞的增生[33]。由此可见，TNF-α在类风湿关节炎的发病过程中占重要地位，也是判断类风湿关节炎愈后的重要指标。
本实验研究结果表明，模型组大鼠 TNF-α 含量明显升高，这可能是由 TNF-α 参与的多种凋亡机制所引起滑膜增生和软骨破坏的主要原因。在实验过程中，马钱子单煎剂组、白术单煎剂组、马钱子配伍白术煎剂组均能有效降低 TNF-α 含量，其中白术单煎剂组与马钱子配伍白术 1:24 煎剂组在缓解 AA 大鼠组织损伤、软骨与骨的破坏和 AA 大鼠足跖肿胀程度上效果更加明显。
Fas是一种存在于细胞膜表面的受体，FasL为Fas的配体，Fas与FasL的结合可导致T细胞对靶细胞的杀伤，使靶细胞凋亡，靶细胞之间的凋亡也可引起机体局部炎症反应。另外由Fas/FasL启动细胞凋亡机制可导致自身免疫系统功能失调和多种致炎因子分泌过量，也可导致细胞间一方死亡或双方死亡，起到免疫下调反应；这可能是引起关节滑膜组织增生这一典型RA病理学变化的主要原因之一。通过实验观察，AA 大鼠模型组滑膜组织中 Fas/FasL 系统的含量异常，提示细胞凋亡存在异常。马钱子配伍白术 1:24 煎剂组则能明显上调 Fas，并降低异常表达的FasL，说明马钱子配伍白术能通过调节 Fas/FasL 系统促进细胞凋亡。
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结 语
一、本实验研究的特色和创新点：
（一）本课题在中医药理论指导下，通过查阅文献资料，对马钱子、白术、RA及细胞凋亡的相关研究进行了系统梳理。并在前期研究的基础上，进一步深入探讨马钱子配伍白术治疗 AA 大鼠的机理。
（二）本课题分别从基因、分子、蛋白水平，应用药理学、病理学等多学科知识，采用病理组织学、Elisa、Western blot 等多种方法，观察了马钱子配伍白术不同配比对 AA 大鼠抗炎、细胞凋亡的影响，并探讨配伍后抗炎作用的机理。
（三）本课题通过 Elisa、Western blot 检测 AA 大鼠细胞凋亡因子，首次探讨马钱子配伍白术对 AA 大鼠细胞凋亡传导通路的影响。
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参考文献（略）