本文是一篇医学论文，本次研究表明，CE 是阿托伐他汀与非诺贝特治疗 NAFLD 的主要靶标，通过评估与调控 CE 含量是否可以改善 NAFLD 预测与治疗，仍可以从以下几个方面进行探究： （1） 肠道菌群如何影响 CE 仍不清晰，具体机制仍需进一步探索。 （2） 实验组两种药物分别只用一个剂量，无法得到剂量-效应关系。
第一章：绪论
1.1 非酒精脂肪肝
1.1.1 非酒精脂肪肝的流行病学特征
非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是非饮酒因素引起的、多种原因导致的一种常见肝病[1]，逐年上升的发病率是慢性肝病在全球范围内日益增长的一个重要原因[2]。NAFLD 是一个总括性术语，包括一系列的肝病，从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎，最终可能发展为肝硬化[3, 4]。
在流行病学研究中，全球范围内的 NAFLD 患病率约为 25％[1]。其中，中国等多数亚洲国家的 NAFLD 患病率处于中上等水平[1, 5]。在美国，该疾病影响 15-46％的成年人[6, 7]，是肝硬化和肝细胞癌的第三大最常见病因[8, 9]。值得关注的是，NAFLD 在儿童群体中的发病率正逐年增加[10, 11]，在全球范围内造成较大的经济负担[12]。因此，继续寻找准确的非侵入性诊断方法和预后生物标志物，开发针对 NAFLD 以及进行性肝病高风险个体的预防与治疗方法仍是当下工作重点。
1.1.2 非酒精性脂肪肝的发病机制
NAFLD 是多种因素同时或通过复杂的相互作用导致的结果，其发病机制尚未完全明确，最初的“二次打击”理论[13]无法充分解释涉及多个因素的 NAFLD 的发病机理，Tilg 和 Moschen[14]提出的“多重打击”学说已逐渐取代过时的“二次打击”学说。该学说反映了 NAFLD 发生和发展的多种潜在途径以及多种损伤之间的相互作用，包括胰岛素抵抗、脂肪组织分泌的促脂因子和炎性细胞因子、肠道菌群、遗传和表观遗传因素[15]、氧化应激、环境和饮食因素等[16, 17]。
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1.2 非酒精性脂肪肝的治疗方法
近年来 NAFLD 发病率逐年增高，因其发病机制复杂，目前对该疾病的了解仍不完全，临床尚无特效药用来治疗 NAFLD[56, 57]。在大多数患者中，NAFLD 管理的第一步是改善生活方式[58]。然而随着生活水平的提高与生活质量的改善，人们的饮食模式倾向于高热量饮食。高糖高脂食物已然成为人们生活中的必需品，这使得饮食限制尤为困难。另一方面，运动的缺乏在 NAFLD 发展中同样起着举足轻重的作用[59]。研究表明运动可以显著改善 NAFLD[60]，然而久坐已经成为日常生活中的一种习惯，人们难以坚持高强度锻炼去改善疾病[59]。因此保持健康的生活方式难以实现，同时无法保障改善效果[61]。因此，探索疾病的发生机制以及研发新型治疗药物成为当下的迫切需求。
1.2.1 阿托伐他汀对非酒精性脂肪肝的作用
尽管没有特效药物用来治疗 NAFLD，但是阿托伐他汀作为一类临床广泛使用的降胆固醇药物用来辅助 NAFLD 的治疗。它通过竞争性抑制 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（一种重要的胆固醇合成限速酶）从而阻止胆固醇的生物合成[62]。他汀类药物除了具有降低胆固醇的作用外，还可以对炎症、纤维化等产生有益作用从而改善慢性肝病[63] [64]。
在一项针对希腊人群阿托伐他汀和冠心病评估研究（n=1600）的事后分析中，他汀类药物的长期治疗（随访 3 年，平均剂量为 24 mg/d，主要为阿托伐他汀）可显著缓解 NAFLD（通过超声和转氨酶活性评定）[65]。相比之下未使用他汀类药物的患者的肝酶活性进一步增加，肝脏超声检查结果为明显恶化[65]。同样在一项评估无代谢性糖尿病综合症治疗效果的事后分析研究中（n=1123；持续时间为 42 个月），包括阿托伐他汀在内的多因素治疗在代谢综合征和 NAFLD 患者中被证明是安全的[66]。此外，在一项肝活检研究中，他汀类药物被证实可以预防肝脂肪变性，纤维化和 NASH 的发生，甚至可以逆转 NASH[67-70]。流行病学研究已将他汀类药物的使用与 NAFLD 患病风险的降低联系起来[71, 72]，长期使用他汀类药物可预防患有 NAFLD 或严重肥胖的受试者的肝脏损害[67]。此外他汀类药物还具有多效性。他汀类药物有助于预防动脉粥样硬化性心血管疾病[73, 74]，其临床益处已在诸如心脏保护研究[75]和苏格兰西部冠状动脉预防研究等临床试验中得到证实[76]。另一方面，阿托伐他汀不仅可有效治疗肥胖和糖尿病，而且还可治疗多种代谢异常，包括冠心病、中风、动脉粥样硬化、慢性心力衰竭和脑血管疾病[77-79]。在这些研究中，他汀类药物表现出良好的耐受性[80, 81]。他汀类药物疗可以影响肠道菌群（Gut microbiota, GM）的组成，而 GM 的这种变化或可解释他汀类药物对代谢的改善作用[82-84]。
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第二章：材料与方法
2.1 实验仪器及试剂
2.1.1 实验设备与仪器 超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪（*Vanquish Q Exactive Plus*100fg 利血平），气相色谱质谱联用仪 GC-MS-QP2010 Ultra（Shimadzu Co.，Tokyo，Shimadzu），Mindray BS-480 全自动生化分析仪，氮吹仪，金属浴，使用 Milli-Q 系统制备了 18.2 MΩ·cm的超纯水（Millipore，美国），制冰机（SANYO，日本），漩涡振荡器（Scientific Industries，美国），冷冻离心浓缩仪（Labconco，美国），低温高速离心机（Thermo，美国），Thermo Fisher Scientific 超低温冰箱，医用冷藏冰箱，高压蒸汽灭菌锅（Biobase，中国），血糖仪及血糖试纸（罗氏，德国），石蜡包埋机（Leica EG1150，德国），全自动轮转式切片机（Leica，德国），冰冻切片机（Leica，德国），数字切片扫描系统（Panoramic MIDI，匈牙利），MiSeq 系统，酶标仪（Thermo，美国），摇床。
2.1.2 实验材料与试剂
正己烷（n-Hexane），99.9%，HPLC（Sigma）；质谱级的乙醇（Sigma）；甲醇（Methyl Alcohol），99%，HPLC（Adamas）；N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰(含 1% 三甲基氯硅烷)（N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA）（百灵威）；甲基叔丁基醚（Tert-Butyl Methyl Ether, MTBE），99%，HPLC（Adamas）；PBS 缓冲液；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染液试剂盒、油红染色液；（南通雨露生物公司）；胰岛素购自通化东宝药业股份有限公司；小鼠谷丙转氨酶与甘油三酯测试试剂盒购自南京建成生物公司；流动项 A: 10mM HCOONH4, 0.1% formic acid, ACN:H2O 60:40；流动项 B: 10mM HCOONH4, 0.1% formic acid, IPA:ACN 90:10；色谱柱：C18 ACQUITY column（2.1 mM × 100 mM × 1.8 μM, Waters, Milford, USA），内衬管（Hamag）；气相瓶（Hamag）；无酶 1.5-mL、2-mL 离心管；1000 µL、200 µL、20 µL、10 µL、2 µL的移液枪（Eppendorf，德国）；Ultrapure RNA 试剂盒（CWBIO，中国北京）；反转录试剂盒（Takara，大津，日本）；第二链 cD NA 合成试剂盒（Beyotime，上海，中国）；凝胶回收试剂盒（Vazyme，南京，中国）；HiFi PCR 混合物（CWBIO）；Ultra SYBR混合物（Yeason，中国上海）。
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2.2 实验方法
2.2.1 临床样本的采集和筛选标准
该研究在开展前申请并得到了江南大学医德委员会的批准。所有参与者在入选前都提供了书面知情同意，这项研究是根据 2013 年“赫尔辛基宣言”的原则（2013 年10 月在巴西福塔莱萨修订）开展和实施。伦理审查编号是 JNU20191105IRB02。 为探究 NAFLD 患者血清中 CE 是否存在显著不同，收集 33 例 NAFLD 患者与 29例对照人群血清样本。根据样本筛选标准，筛选年龄、性别配对的 NAFLD 组 6 例，正常组 6 例。根据 NAFLD 的诊断防治指南进行入选对象的筛选[103]，首先根据医院影像学结果确定是否为脂肪肝患者，结合病史与生活史断定本研究所选的 NAFLD 患者和所选对照均符合医学诊断标准[104]。纳入对象具有以下特征时，则剔除研究。（1）拒绝合作的患者；（2）患有严重肝脏、胃肠以及肾病等其他影响指标的疾病患者；（3）正在服用可能影响观察指标的药物者。纳入对象采血早晨禁食，血液样本于晨 8-10 点间采集。血样存于 4℃，当天处理；低温运输，减少晃动及血溶；上层血浆存于-80℃。
2.2.2 非酒精性脂肪肝病动物模型的建立
2.2.2.1 实验动物
动物实验方案经江南大学动物伦理委员会批准。所有程序均经江南大学伦理委员会以协议号（JN.No20190330c0700710【36】）批准。从 SPF（北京）生物技术有限公司（中国）购买 6 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，适应实验室条件 1 周，其间动物可以自由饮水和进食。（1）60%高脂饮食或正常饮食喂养 13 周，建立 NAFLD 模型。将 24只小鼠分为正常饮食组（ND）、高脂饮食组（HFD）、阿托伐他汀治疗组（HFD-Ator，20 mg/kg）以及非诺贝特治疗组（HFD-Feno，100 mg/kg），治疗 10 周隔天给药，HFD组小鼠给予生理盐水。（2）使用 6 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，60%高脂饮食喂养 13周，建立 NAFLD 模型。将 35 只小鼠分为：高脂饮食组（HFD）、阿托伐他汀治疗组（HFD-Ator，20 mg/kg）、非诺贝特治疗组（HFD-Feno，100 mg/kg）、外源补充 CE 饮食的阿托伐他汀治疗组（HFD-1%CE-Ator）以及外源补充 CE 饮食的非诺贝特治疗组（HFD-1%CE-Feno）。治疗 10 周隔天给药，HFD 组小鼠给予生理盐水。治疗结束时，所有动物过夜禁食，然后通过腹膜内注射 10%水合氯醛（350 mg/kg）进行麻醉，然后摘除眼球收集血液。以 4℃，2000 rpm/min 离心 15 min 从血液样品中分离血清，并将所有小鼠的肝脏样品立即放入液氮并保存在-80℃。
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第三章：结 果 ................................ 12
3.1 NAFLD 患者和高脂诱导的 NAFLD 小鼠血清中 CE 显著升高 ................... 12
3.1.1 临床样本血清 TC 和 CE 含量升高 ........................... 12
3.1.2 高脂诱导 NAFLD 小鼠血清 TC 和 CE 含量升高 .............................. 12
第四章：讨论 ............................. 37
4.1 NAFLD 中 CE 的潜在作用 ............................... 37
4.2 使用胆固醇酰基转移酶抑制剂或是未来治疗 NAFLD 的有效手段 ............. 37
4.3 减少 CE 的摄入量或可进一步改善药效 .................................... 38
主要结果及展望 .......................... 40
主要结果 .................................. 40
展望 ................................. 40
第四章：讨论
4.1 CE 在 NAFLD 中的潜在作用
当前的研究发现，与正常对照组相比，病例组 NAFLD 患者血清中 CE 含量显著上升（P<0.05）（图 1-1）。相似的，在高脂诱导的 NAFLD 小鼠中，血清（图 1-2）与肝脏（图 1-3）CE 含量显著增加，动物模型结果与临床结果相似。此外 LC-MS 结果表明 NAFLD 患者（图 1-4）与小鼠血清（图 1-5）中多种 CE 含量显著上调。
先前的几项研究表明成年肥胖受试者的血清胆固醇合成增加[113-115]。一项肥胖儿童血清中固醇分析的数据也显示肥胖儿童血清中胆固醇的生物合成增加，其中男孩的血清 FC 浓度无差异，但肥胖女孩的血清 FC 水平略高于正常女孩（P=0.007）[116]。尽管该研究未分析多种血清 CE 的具体变化，但胆固醇花生四烯酸酯浓度在超重或肥胖男孩血清内增加，血清总 CE 水平与 TG 密切相关（r=0.763，P<0.001）[116]。此外，另一项研究在 17 名病态肥胖受试者的手术肝活检中检测了肝胆固醇的代谢变化，并将其与 15 名非肥胖对照组的样本进行了比较[117]。结果表明，与对照组相比，肥胖受试者肝脏中 CE 的含量增加了三倍（P<0.0001）[117]。
在动物模型中，高脂高胆固醇（HFHCC）饮食组小鼠表现出明显的高胆固醇血症，研究人员发现饲喂 HFHCC 饮食的小鼠与对照饮食的小鼠相比，肝脏中的 TC 和所有CE 含量均显著增加，并且血清中多种 CE 水平均呈现出显著升高趋势[118]。此外与对照饮食相比，HFHCC 饮食后血清中的 FC 水平未发生改变[118]。研究人员普遍认为，肝脏中 FC 升高是 NAFLD 进一步发展的原因之一，NAFLD 炎症的严重程度与 FC 水平升高有关[29]，但 CE 在 NAFLD 中的作用仍不清晰。在一项非酒精性脂肪肝病的脂质组学分析中，报道了从 NAFLD 到 NASH 肝脏中 FC 逐渐增加，但 CE 的水平不变[31]。然而这项研究的潜在局限性是对照组的肥胖性质和研究人群的规模较小[31]。
本项研究表明 CE 在 NAFLD 患者与小鼠模型血清中均显著升高，并且临床样本中血清 CE 的含量与 ALT、GGT、LDH、LDL、HDL 和 TG 等 NAFLD 相关指标呈显著相关（图 1-7）。这些结果提示 CE 可能是 NAFLD 的潜在治疗靶点。
医学论文参考
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主要结果及展望
主要结果
（1）与对照组相比，NAFLD 患者以及 NAFLD 小鼠血清中 CE 含量显著升高，NAFLD 小鼠肝脏内 CE 含量显著升高。
（2）阿托伐他汀与非诺贝特有效缓解高脂诱导的小鼠 NAFLD，并显著降低小鼠肝脏 CE 含量。
（3）外源性回补 CE 会削弱阿托伐他汀与非诺贝特对 NAFLD 的治疗效果，回补CE 会增加甘油三酯合成途径中 Dgat2 的表达。
（4）两种药物通过不同机制影响 CE 含量，非诺贝特影响 CE 合成酶降低 CE 含量缓解 NAFLD，阿托伐他汀通过影响 GM 降低 CE 含量发挥疗效。
参考文献（略）