1 材料和方法
1.1 主要试剂
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1.2 PEI/SPION 基因载体的构建
1.3.1 胆固醇接枝聚醚酰亚胺(PEI-g-Chol)的合成
枝状的聚醚酰亚胺(PEI, 分子量：2 kDa)在加入 N,N'-羰基二咪唑(CDI)的条件下能够接枝胆固醇(Chol)。用 N,N'-羰基二咪唑(CDI)对胆固醇(Chol)分子中的羟基进行活化制备中间体，并进一步与支链聚醚酰亚胺(PEI)上的氨基反应，获得部分疏水分子接枝的双亲性 PEI 分子(PEI-g-Chol)，具体步骤如下：
a. 称取 3 g 胆固醇粉末，量取 20 m L 无水四氢呋喃(THF)。取 50 mL 离心管，在室温条件下将 3 g 胆固醇溶解于 20 mL 无水四氢呋喃中，并加入 1.51 gN,N'-羰基二咪唑(CDI)。
b. 将 a 步所得混合物放置于磁力搅拌器上，以 60 °C 的温度反应 3 小时。c. 搅拌反应 3 小时后，用真空干燥法除去反应体系的溶液，得到的粗产物用硅胶柱色谱法进行纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯=2/1。
d. 将 c 步得到的胆固醇衍生物(Chol-CI)用氢核磁共振波谱(1H NMR)和碳核磁共振波谱(13C NMR)进行鉴定，得到的胆固醇衍生物为 3.1g，纯度为 83%的白色固体。
e. 称取 500mg 无水聚醚酰亚胺，量取 10 mL 纯的二氯甲烷(DCM)，将 500mg无水聚醚酰亚胺溶解于 10 m L 二氯甲烷中，并加入 280mg 胆固醇衍生物(Chol-CI)。
f. 将 e 步混合物在室温条件下反应 4 小时后，用真空干燥法除去反应体系中的二氯甲烷，将得到的粗产物溶于水并在水中进行透析。
g. 将透析后的产物用冷冻干燥法进行纯化，纯化后用氢核磁共振波谱(1HNMR)进行鉴定。
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2 结果
2.1 PEI/SPION 基因载体的构建
2.1.1 胆固醇接枝聚聚醚酰亚胺(PEI-g-Chol)的合成
胆固醇与 N,N'-羰基二咪唑(CDI)反应后，得到具有活化羟基的胆固醇衍生物(Chol-CI)。在氢核磁共振波谱(1H NMR)中(图 2.1)，合成的胆固醇衍生物(Chol-CI)出现咪唑基团特征峰(b, c, d 峰)，由于酯键的形成，临近羟基的 a 峰的化学位移由 3.55 ppm 变为 4.84 ppm。随后，胆固醇衍生物(Chol-CI)与聚醚酰 亚 胺 (PEI, 分 子 量 : 2 kDa) 的 氨 基 反 应 得 到 胆 固 醇 接 枝 聚 醚 酰 亚 胺(PEI-g-Chol)。在氢核磁共振波谱(1H NMR)中(图 2.1)，PEI 特征峰的出现和咪唑基团特征峰的消失，证明胆固醇衍生物(Chol-CI)与聚醚酰亚胺(PEI)成功连接。通过氢核磁共振波谱(1H NMR)中(图 2.1)，特征峰的积分面积计算得出胆固醇的接枝率为 5 %。
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2.2 PEI/SPION/siR NA 复合物体外验证
2.2.1 PEI/SPION/siRNA 复合物琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
siR NA 带负电荷，PEI/SPION 带正电荷，siRNA 与 PEI/SPION 结合后会中和复合物表面电荷。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PEI/SPION 与 siR NA 以不同的氮磷质量比(N/P 0, 12.5, 25, 50, 100)复合后，随着 N/P 的升高，siRNA 条显著变弱，当 N/P 为 25 时，无 siR NA 条带出现(图 2.5 A)。通过 Image J 软件勾画 siR NA条带，计算条带的灰度值做柱状图(图 2.5 B)并进行统计学分析。结果表明，氮磷比为 12.5 与氮磷比为 0 相比，差异有统计学意义，P = 0.0059 (表 2.6 )。
2.2.2 PEI/SPION/siRNA 复合物 siR NA 肝素钠释放实验
1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，肝素钠与 siR NA 质量比为 5, 10, 20, 40 能够释放PEI/SPION/siRNA复合物中的siRNA，在质量比10效果最佳。释放的siRNA与自由 si RNA 的电泳位置相同，证明 si RNA 原有结构没有发生变化(图 2.6 A)。通过 Image J 软件勾画 si RNA 条带，计算条带的灰度值做柱状图(图 2.6 B)并进行统计学分析，结果显示不同质量比(5, 10, 20, 40)与对照组 siR NA 相比无统计学意义(表 2.7 )。
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3 讨论..................................33
4 结论..............................................36
3 讨论
在分子水平进行成像和治疗，需要设计和合成比较理想的分子探针。理想的分子探针需要具有以下特点: (1) 具有良好的生物相容性； (2) 尺寸均一可控，能够穿透各种生物屏障； (3) 在体内相对稳定，有较长的体内循环时间，便于分子探针主动或被动到达靶点；(4) 易于修饰，能够偶联各种分子用于成像或治疗。目前用于肿瘤研究的分子探针主要为金(Au)纳米材料、钆(Gd)纳米材料、脂质体和超顺磁性氧化铁纳米材料等[38-41]。
在胰腺癌分子探针研究中，Wang 等开发了一种靶向凝集素/整合素的双特异性分子探针的共轭复合物(Gd-Cy7-PTP/RGD)，用于胰腺癌的体内磁共振/近红外成像(MRI/NIRF)[42]。该分子探针由 4 部分组成，Gd 用于磁共振成像，荧光染料 Cy7 用于近红外荧光成像，PTP 肽靶向胰腺癌细胞表面特异性过表达的凝集素，RGD 肽则靶向表达于胰管上皮细胞和血管生成的整合素。该研究结果表明 PTP/RGD 多肽的结合增强了探针的特异性，此外，PTP 和 RGD 在体内外联合使用时，能同时结合恶性上皮细胞和肿瘤间质血管，达到“多层次”靶向作用。在 MRI/NIRF 双模成像的指导下，Gd-Cy7-PTP/RGD 分子探针能够实现胰腺癌的诊断和标记手术切除范围。
为了靶向诊断胰腺癌，Xin 等将钆-金(Gd-Au)纳米团簇与蛋白多糖-1(GPC-1)抗体结合，开发了一种双模态成像分子探针(Gd-Au-NC-GPC-1)。该分子探针中，Gd 用于磁共振成像，Au 用于近红外荧光成像，GPC-1 抗体用于靶向胰腺癌细胞高表达的肝素蛋白多糖。该研究结果表明，Gd-Au-NC-GPC-1纳米探针在体内和体外均能够靶向表达 GPC-1 的胰腺癌细胞，通过磁共振成像和荧光成像均能检测到动物模型体内的 Gd-Au-NC-GPC-1 纳米探针[43]。
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4 结论
1.PEI/SPION 基因载体为带正电荷的纳米团簇结构，能够自动复合和释放siR NA，具有较高的磁共振 T2 弛豫效率和增强效果。
2.PEI/SPION/siRNA 分子探针具有较高的血清稳定性，能够通过细胞吞噬作用进入细胞，转染人胰腺癌细胞后对 MUC4 基因产生良好的沉默效应。
3.PEI/SPION/siRNA 分子探针能够抑制胰腺癌动物模型瘤体生长和降低瘤体中 MUC4 的表达。
4.PEI/SPION 载体有望成为磁共振对比剂或医学影像可视化基因载体，PEI/SPION/siRNA 多功能影像分子探针为诊断和治疗胰腺癌提供了新方法。
参考文献（略）